生物工程

重组枯草芽孢杆菌全细胞催化高效合成2′-脱氧腺苷

陈 伟1，陈令伟1，李文超2，郑玲辉1*

（1.杭州珲益生物科技有限公司，浙江 杭州 310011；2.天津科技大学 生物工程学院，天津 300457）

摘要：以枯草芽孢杆菌168（简写为BS）为宿主，以脱氧胸苷和腺嘌呤为底物，异源表达组合来源于大肠杆菌（E. coli）的嘧啶核苷磷酸化酶（PyNP）与嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）作为催化酶源，全细胞催化合成2′-脱氧腺苷（dA）。首先，以BS 敲除内源性的PNP（由基因deoD 编码，Gene ID: 940038）后的菌株BS0 为出发菌株，经过PyNP1 酶（来源于E. coli，Gene ID: 948901）与PNP3 酶（来源于E. coli，Gene ID: 945654）的重组表达得到CW3，再优化PyNP1 与PNP3 的对核糖体结合位点（RBS）序列得到重组菌株CW3-3，在CW3-3 作用下，dA 的产量为133.4 g/L，脱氧胸苷的转化率为64.3%；其次，以CW3-3 为出发菌株，利用互作短肽构建自组装多酶复合物，经过PyNP1 酶N 端融合RIAD，PNP3 酶C 端融合RIDD（其中RIAD 和RIDD 为互作短肽标签）处理后，PyNP1 酶N 端融合4 个RIAD 标签得到重组菌株CW17，在其作用下，dA 的产量达到179.6 g/L，显著提升了底物转化率；最后，对重组菌株CW17 全细胞催化条件细胞添加质量浓度及催化反应温度进行了优化，在细胞添加质量浓度为150 g/L，反应温度50 ℃条件下，dA 的产量达到200.3 g/L，脱氧胸苷的转化率为96.6%。

关键词：2′-脱氧腺苷；嘧啶核苷磷酸化酶；嘌呤核苷磷酸化酶；互作短肽；枯草芽孢杆菌；全细胞催化；生物工程

中图分类号：TQ460.1；TQ426.97

文献标识码：A

文章编号：1003-5214 (2023) 11-2436-09

收稿日期：2023-02-23; 定用日期：2023-05-19;

DOI: 10.13550/j.jxhg.20230127

基金项目：天津市教委科研计划项目（2019KJ237）

作者简介：陈 伟（1989—），男，博士，E-mail：doctor.chen1989@foxmail.com。联系人：郑玲辉（1978—），男，硕士，E-mail：zhenglinghui@huidabiotech.com。

Highly efficient production of 2′-deoxyadenosine by whole-cell catalysis of engineered Bacillus subtilis

CHEN Wei1, CHEN Lingwei1, LI Wenchao2, ZHENG Linghui1*

（1. Hangzhou Hizyme Biotech Co., Ltd., Hangzhou 310011, Zhejiang, China; 2. College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, Tianjin, China）

Abstract: 2′-Deoxyadenosine (dA) was synthesized from the whole cell of Bacillus subtilis 168 (BS for short), which were catalyzed by the heterologous enzymes of pyrimidine nucleoside phosphorylase (PyNP)and purine nucleoside phosphorylase (PNP) from Escherichia coli, using deoxythymidine and adenine as substrate.The recombinant B. subtilis CW3-3, which was obtained from recombinant expression of PyNP1 enzyme (from E. coli, Gene ID: 948901) and PNP3 enzyme (from E. coli, Gene ID: 945654) and optimization of the ribosome binding site (RBS) for PyNP1 and PNP3 enzyme using BS0 strain (BS strain knocked out of endogenous PNP and encoded by Gene deoD, Gene ID: 940038) as starting strain, exhibited a yield of dA 133.4 g/L and a conversion rate of deoxythymidine 64.3%.Moreover, B. subtilis CW3-3 was further used as starting strain to construct a self-assembled multi-enzyme complex with interacting short peptides.After treatment with N-terminal fusion RIAD of PyNP1 enzyme and C-terminal fusion RIDD of PNP3 enzyme (RIAD and RIDD are interacting short peptide labels), the N-terminal fusion of PyNP1 enzyme fused with four RIAD labels to obtain recombinant strain B. subtilis CW17, which improved the yield of dA to 179.6 g/L.Finally, the cell addition mass concentration and catalytic reaction temperature conditions of the recombinant B. subtilis CW17 whole-cell catalysis were optimized and further boosted the production of dA to 200.3 g/L and the conversion rate of deoxythymidine to 96.6%.

Key words: 2′-deoxyadenosine; pyrimidine nucleoside phosphorylase; purine nucleoside phosphorylase;interacting short peptide; Bacillus subtilis; whole-cell catalysis; bioengineering

2′-脱氧腺苷（dA）是脱氧核糖核酸（DNA）的结构组成物质[1-3]，其被广泛应用于人工合成寡聚核苷酸等领域，是基因工程药物研究领域的重要原材料[4-7]。此外，对dA 的碱基或脱氧核糖进行修饰获得的核苷类衍生物不仅可以直接促进生物体内蛋白质与核酸的代谢合成[8-11]，而且可以作为化学中间体用于抗病毒、抗肿瘤及抗艾滋病等药物的合成[4-7,10-13]。

当前，dA 的制备主要有脱氧核糖核酸降解法[14]、化学合成法[15-19]和生物酶催化法[20-27]。脱氧核糖核酸降解法中底物脱氧核糖核酸稳定性较差，容易在制备过程中产生大量副产物，收率较低[14]。化学合成法则因制备成本高、环境不友好等无法满足当前市场需求[15,17-19]。相比于以上两种制备方法，生物酶催化法则可利用具有高核苷磷酸化酶活性的细胞作为催化酶源，以脱氧胸苷及腺嘌呤作为反应底物实现 dA 的合成[22-25]。LIANG 等[26]在大肠杆菌Escherichia coli BL21 内过表达内源性的核苷磷酸化酶，可实现dA 的高效催化合成，腺嘌呤的转化率可达96%。刘国生等[25]利用聚丙烯酰胺固定化酶源细胞，重复催化10 次后脱氧胸苷的转化率仍达32%。生物酶催化法不仅可以满足dA 市场的增长需求，而且绿色环保，是解决资源可持续化问题的最佳途径之一[22-28]。但生物酶法依然存在底物浓度低，dA 生产成本偏高，进而导致其大规模应用受限等问题[21-26]。王建琨[20]利用大肠杆菌游离细胞进行生物转化合成dA，当反应底物脱氧胸苷质量浓度为13 g/L 时，脱氧胸苷转化率为56.2%，底物质量浓度及底物转化率均较低。此外，LIANG 等[26]在E. coli内过表达内源性的核苷磷酸化酶实现了dA 的催化合成，虽然腺嘌呤的转化率可达96%，但最终得到的dA 质量浓度仅为14.4 g/L，无法满足工业化生产需求。

针对生物酶法存在的问题，本文以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis 168）为宿主，异源表达并组合优化不同来源的嘧啶核苷磷酸化酶（PyNP）与嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）以实现dA 的全细胞催化合成（反应路线如下所示），为dA 的生产提供一种绿色高效的催化合成工艺。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

所用菌株如表1 所示。

Prime STAR DNA 聚合酶，生物试剂，宝生物工程（大连）有限公司；Taq DNA 聚合酶，生物试剂，南京诺唯赞生物科技有限公司；氯霉素（美国药典级，色谱含量为97%～103%）、氨苄青霉素（钠盐，美国药典级，含量为845～988 mg/g）、卡那霉素（硫酸盐，美国药典级，含量≥750 mg/g）、质粒提取试剂盒（生物试剂），生工生物工程（大连）股份有限公司；博莱霉素（生物试剂，质量浓度为100 g/L）、DNA 片段回收试剂盒（生物试剂），美国赛默飞世尔科技有限公司；无缝克隆试剂盒，生物试剂，上海碧云天生物科技有限公司；脱氧胸苷（2′-脱氧胸苷，医药级，HPLC 含量≥99%），芜湖华仁科技有限公司；腺嘌呤（医药级，HPLC 含量≥99%），北京百灵威科技有限公司；葡萄糖（无水），分析纯，国药集团化学试剂有限公司；酵母粉（YP600）、酵母抽提粉（FM808）、酵母膏（LM800），安琪酵母股份有限公司；蛋白胨（Y001A），北京鸿润宝顺科技有限公司；琼脂粉（A8190），北京索莱宝科技有限公司；除特别说明，其他常规试剂均为国药分析纯。

LB 培养基（均为质量浓度，下同）：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠10 g/L，固体培养基额外添加质量分数为2%的琼脂粉。

种子培养基：葡萄糖30 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏10 g/L、酵母抽提粉5 g/L、氯化钙2 g/L、硫酸镁2 g/L、磷酸二氢钾5 g/L，灭菌前用质量分数为30%的氢氧化钠溶水液调节pH 至7.0。

发酵培养基：葡萄糖30 g/L、酵母膏10 g/L、酵母抽提粉10 g/L、吐温-80 6 g/L、柠檬酸铵4 g/L、硫酸镁3 g/L、磷酸二氢钾6 g/L、氯化钾3 g/L、氯化钙3 g/L，灭菌前用质量分数为30%的氢氧化钠水溶液调节pH 至6.0。

培养基中添加相应的抗生素：氨苄青霉素100 µg/mL、氯霉素50 µg/mL、卡那霉素30 µg/mL、博莱霉素30 µg/mL。

T100 聚合酶链反应仪（PCR），美国伯乐公司；YM 型立式压力蒸汽灭菌器，上海三申医疗器械有限公司；SW-CJ-1FD 型超净工作台，苏州苏净集团安泰空气技术有限公司；ZQZY-108 型实验室恒温培养摇床，上海知楚仪器有限公司；1260 型高效液相色谱仪，美国安捷伦科技公司；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器，上海力辰邦西仪器科技有限公司；Scientz-ⅡD 超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；Sorvall Lynx 4000 型落地式冷冻离心机，美国赛默飞世尔科技有限公司；TGL-10C 飞鸽台式高速离心机，上海安亭科学仪器厂；S210 型pH 计，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株构建

质粒表达载体的构建：本文所构建的表达载体如表2 所示。以构建质粒pHT-Pveg-PyNP1 为例，首先利用引物pHT-F1、pHT-R1 以质粒pHT 为模板进行扩增得到线性化质粒片段pHT-1；其次，利用引物PyNP1-F1、PyNP1-R1 从E. coli BL21 基因组中扩增出目的基因PyNP1 片段；之后，利用无缝克隆试剂盒将目的基因片段PyNP1 与线性化质粒片段pHT-1连接转入E. coli JM109 中，测序选择正确的单菌落进行培养提取重组质粒pHT-Pveg-PyNP1，备用。

表达敲除框的构建：利用Cre/loxp 重组酶系统进行基因组编辑[29]。以敲除 PNP 酶的编码基因deoD 为例，首先利用引物 deoD-U-F、deoD-U-R从 B. subtilis 168 基因组中扩增出上游同源臂deoD-U，利用引物 deoD-D-F、deoD-D-R 从 B.subtilis 168 基因组中扩增出下游同源臂deoD-D；其次，在上下游同源臂之间融合添加相应的抗性标签基因与loxp 位点，最终获得deoD 基因的表达敲除框。

多酶复合物的构建：选择3 种互作短肽（PDZ与PDZ lig、RIAD 与RIDD、CCDIA 与CCDIB）进行多酶复合物的构建。以构建基于RIAD-RIDD 互作短肽的多酶复合物为例，利用(GGGGS)3（代表3段重复的GGGGS 氨基酸序列）作为Linker，将单个 RIAD 序列融合至 PyNP 酶的 N 端，构建pHT-Pveg-RIAD-PyNP 质粒。其次，利用(GGGGS)3 Linker 将单个RIDD 序列融合至PNP 酶的C 端，构建 p43NMK-P43-PNP-RIDD 质 粒。 最 后， 将pHT-Pveg-RIAD-PyNP 与p43NMK-P43-PNP-RIDD 质粒依次转入BS0 的感受态细胞。调控多酶复合物的催化亚基比例时，在pHT-Pveg-RIAD-PyNP 质粒的RIAD 序列N 端继续融合多个RIAD 序列，或在p43NMK-P43-PNP-RIDD 质粒的RIDD 序列C 端融合多个RIDD 序列，多个重复RIAD 或RIDD 序列之间无需添加linker。

RBS 序列优化：使用 RBS 预测网站“RBS calculator”(https: //salislab.net/software/predict_rbs_calculator)设计PyNP1 与PNP3 基因相对应的最优RBS 序列RBSopPyNP 与RBSopPNP。引物设计与合成：引物由SnapGene 进行设计，序列的合成与测序验证由安升达苏州实验室完成。本文所用引物的名称和序列如表3 所示。

1.2.2 全细胞催化实验

将表1 中本实验自行构建的重组菌株涂布于LB固体培养基上，37 ℃培养12 h，得到重组菌株单菌落。取形态较大、呈椭圆形的重组菌株单菌落接种于20 mL 种子培养基中，30 ℃、250 r/min 培养24 h，然后将上述种子培养液以体积分数10%的接种量接至50 mL 发酵培养基中，30 ℃、250 r/min 培养72 h。将发酵液经冷冻离心机进行低温高速离心（4 ℃，10000 r/min，10 min）以收集细胞，–20 ℃冷冻备用。

催化体系：在100 mL 反应瓶中，底物脱氧胸苷20 g（82.57 mmol）和腺嘌呤11.16 g（82.57 mmol）以n（脱氧胸苷）∶n（腺嘌呤）=1∶1 投入至300 mmol/L的磷酸钠缓冲液（pH=7.0）中（反应体系总量为100 mL），加入质量浓度（以催化反应体系体积计，下同）为100 g/L 的细胞，温度40 ℃，转速200 r/min下恒温搅拌2 h。

1.2.3 全细胞催化条件的优化

细胞添加质量浓度的优化：在100 mL 反应瓶中，将底物脱氧胸苷20 g（82.57 mmol）和腺嘌呤11.16 g（82.57 mmol）以n（脱氧胸苷）∶n（腺嘌呤）=1∶1 投入至50 mL 磷酸钠缓冲液（300 mmol/L，pH 7.0）中，加入质量浓度分别为50、100、150、200、250 g/L 的细胞，充分搅拌后，继续加入300 mmol/L 的磷酸钠缓冲液（pH 7.0），使催化反应体系总量为100 mL。随后，在温度40 ℃，转速200 r/min 条件下恒温搅拌2 h 后，用HPLC 检测dA的含量以确定最适细胞添加质量浓度。

催化反应温度的优化：在100 mL 反应瓶中，将底物脱氧胸苷20 g（82.57 mmol）和腺嘌呤11.16 g（82.57 mmol）以n（脱氧胸苷）∶n（腺嘌呤）= 1∶1投入至50 mL 磷酸钠缓冲液（300 mmol/L，pH 7.0）中，加入质量浓度为150 g/L 的细胞，充分搅拌后，继续加入300 mmol/L 的磷酸钠缓冲液（pH 7.0），使催化反应体系总量为100 mL。随后，将全细胞催化体系分别置于35、40、45、50、55、60 ℃下，转速200 r/min 下恒温搅拌2 h 后，用HPLC 检测dA的含量以确定最适反应温度。

1.2.4 dA 含量及脱氧胸苷转化率测定

用高效液相色谱仪（HPLC）对脱氧胸苷及dA进行定量分析，采用外标法，根据HPLC 谱图中脱氧胸苷和dA 的峰面积计算催化反应液中脱氧胸苷和dA 的含量[25]。催化反应结束后，取1 mL 反应液进行低温高速离心（4 ℃，10000 r/min，10 min）沉淀细胞，上清液经0.25 µm 滤膜过滤，用去离子水稀释100 倍后作为待测样品，对反应液中的脱氧胸苷和dA 进行HPLC 检测。测试条件为色谱柱：Inertsil ODS-3 (150 mm×4.6 mm×5 µm)；检测波长254 nm；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；进样量5 µL；流动相A：20 mmol/L 磷酸二氢铵水溶液；流动相B：甲醇，线性梯度洗脱。并按下式计算脱氧胸苷的转化率：

式中：c1 为催化反应后反应液中dA 的浓度，mol/L；c2 为催化反应体系中脱氧胸苷的起始浓度，mol/L。

2 结果与讨论

2.1 核苷磷酸化酶的组合表达及RBS 优化

脱氧胸苷作为核糖基供体，需经过嘧啶核苷磷酸化酶（PyNP）脱去胸腺嘧啶基团，并在嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）的作用下，以腺嘌呤为碱基供体，催化合成dA，因此，dA 的合成需要PyNP 与PNP的共同作用[20-24]。

不同宿主来源的核苷磷酸化酶其催化活性与特异性存在显著差异，因此，通过表达不同宿主来源的核苷磷酸化酶以确定最适的组合。基于B. subtilis 168 基因组数据查阅，发现其具有内源性的 PNP（由基因deoD 编码，Gene ID: 940038）。为了保证实验变量的唯一性，首先利用表达敲除框对基因deoD 进行敲除，获得菌株BS0。其次，选择pHT质粒作为表达载体，利用组成型启动子Pveg 分别控制异源酶 PyNP1（来源于 E. coli，Thymidine phosphorylase，Gene ID: 948901）、PyNP2（来源于B. stearothermophilus TH6-2，UniProtKB Sequence ID: P77836.1）的表达，获得重组质粒pHT1 和pHT2。之后，选择p43NMK 质粒作为表达载体，利用组成型启动子P43 分别控制PNP1（来源于Citrobacter amalonaticus ATCC25405 ， NCBI Sequence ID:BCU49562.1）、PNP2（来源于B. stearothermophilus TH6-2，UniProtKB Sequence ID: P77834.1）、PNP3（来源于E. coli，Gene ID: 945654）、PNP4（来源于B. subtilis）的表达，获得重组质粒p43NMK1、p43NMK2、p43NMK3 和p43NMK4（图1a）。将重组质粒pHT 系列与p43NMK 系列两两随机组合表达，获得了重组菌株CW1～CW8。然后，将这8 株重组菌株进行全细胞催化合成dA，以验证不同宿主来源的核苷磷酸化酶组合表达时 dA 的合成情况，结果如图1b 所示。

由图1b 可以看出，8 株重组菌株均能够转化脱氧胸苷和腺嘌呤生成dA。然而，PyNP1 表达酶的4株重组菌株其产量与转化率均明显高于PyNP2 表达酶的重组菌株。其中，CW3 菌株的dA 产量最高，为113.1 g/L，脱氧胸苷转化率为54.5%。结果表明，不同的核苷磷酸化酶组合表达能够显著影响dA 的全细胞催化合成效果。

为了进一步提高dA 的产量及脱氧胸苷转化率，对CW3 菌株内的核苷磷酸化酶表达框中的RBS 序列进行优化。使用RBS calculator 分别设计酶PyNP1与PNP3 的最优RBS 序列，获得了理论最优RBS序列RBSopPyNP（对应酶PyNP1）：CCGGGGAAAA CTACCCCCGCGAACGAAAAGGAGGTTTTATTT 与RBSopPNP（对应酶PNP3）：CGAAATTTTCTATCACG AGACCAGGAGGTATTTT。将pHT1质粒与p43NMK3质粒上的原始RBS 序列分别替换为RBSopPyNP 和RBSopPNP，获得重组质粒pHT1-1 与p43NMK3-1，并分别验证RBS 序列优化对dA 产量的影响，结果如图2 所示。

由图2 可以看出，单独优化 PyNP1（菌株CW3-1）或PNP3（菌株CW3-2）的重组菌株合成dA 的能力均有明显提高。

菌株CW3-1 的脱氧胸苷转化率为61.6%，dA 产量为127.8 g/L，比菌株CW3 产量（113.1 g/L）提高了13.0%。由于单独优化酶PyNP1 或PNP3 的RBS序列时，dA 产量均有所改善，因此，将酶PyNP1 和PNP3 的RBS 序列组合优化以验证其对dA 产量和脱氧胸苷转化率的影响，菌株CW3-3 的dA 产量继续提升，达到133.4 g/L，比菌株CW3产量提升了17.9%，脱氧胸苷转化率为64.3%。结果表明，通过优化表达框的RBS 序列，提高起始翻译速率，能够实现目标酶PyNP1 和PNP3 的高效表达，最终提高dA 的产量。

2.2 构建自组装多酶复合物提升催化效率

目前，利用互作短肽标签，构建空间上组织有序的多酶复合物能够有效改善多酶连续催化反应的整体效率[30-31]。本文拟利用互作短肽标签，将酶PyNP1 与PNP3 在胞内形成自组装多酶复合物，进一步提高dA 的产量。选择3 对不同的互作短肽标签（RIAD-RIDD、CCDIA-CCDIB、PDZ-PDZ lig）进行构建表达，如图3a 所示，分别将RIAD、CCDIA与PDZ 标签融合至酶PyNP1 的N 端，将RIDD、CCDIB、PDZ-lig 融合至PNP3 的C 端。

将含有自组装多肽标签的重组菌株进行催化合成dA，结果如图3b 所示。从图3b 可以看出，含有PDZPDZ lig 的重组菌株CW9 的dA 产量降至106.5 g/L，脱氧胸苷转化率51.3%，与单独表达PDZ-PyNP1 的重组菌株dA 合成能力类似，推测原因是PDZ 标签融合至PyNP1 酶的N 端后，影响了PyNP1 酶自身的催化活性，从而导致dA 产量降低。与菌株CW9相反，重组菌株CW10 与CW11 的dA 产量均有明显提高，其中菌株CW10 的dA 产量达到156.7 g/L，比CW3-3 菌株（133.4 g/L）提升了17.5%。此外，单独表达RIAD-PyNP1 或PNP3-RIDD 的菌株其dA产量与CW3-3 菌株相比并未出现明显变化，该结果佐证了菌株 CW10 的 dA 产量提升是因为胞内PyNP1-PNP3 多酶复合物的成功构建。

此外，RIAD-RIDD 互作短肽标签可通过调节其催化亚基比例，调控多酶复合物体系内多个酶的化学计量比，从而进一步提高整体的催化效率。以菌株CW10 为改造宿主，通过增加RIAD 或RIDD 标签的串联拷贝数实现PyNP1-PNP3 多酶复合物的计量比调控，并对改造获得后的重组菌株 CW12～CW18 进行dA 合成，结果如图4 所示。

由图4 可以看出，当单独增加RIDD 标签的串联拷贝数时，多酶复合物中的PyNP1 酶数量增多，dA产量略微升高，菌株CW13 的dA 产量达到164.5 g/L。而单独增加RIAD 标签的串联拷贝数时，dA 产量均有明显提升。当PyNP1 酶的N 端融合4 个RIAD 标签时，得到重组菌株CW17，此时dA 产量达到179.6 g/L，与菌株CW10（156.7 g/L）相比提升了14.6%。

结果表明，调控PyNP1-PNP3 多酶复合物的化学计量比，增加多酶复合物内PNP3 的数量，能有效提高dA 的催化合成效率。

2.3 全细胞催化合成dA 的条件优化

细胞添加量在一定程度上反映出催化体系中核苷磷酸化酶的含量，因此，以催化反应体系总体积量不变的前提条件下，考察了重组菌株CW17 不同细胞添加质量浓度（50、100、150、200、250 g/L）对dA 产量及脱氧胸苷转化率的影响，结果见图5a。

由图5a 可知，当细胞添加质量浓度从50 g/L逐渐升至250 g/L 时，dA 产量呈先升高后下降的趋势，且在细胞添加质量浓度为150 g/L 时，dA 的产量达到186.5 g/L，底物脱氧胸苷转化率为89.6%。当催化体系中的细胞添加质量浓度超过150 g/L 后，催化体系中的全细胞浓度增加明显，导致反应体系较为黏稠，不利于全细胞和底物的充分混合接触，相同反应时间内，在一定程度上减缓了反应的进行，从而导致催化产物量降低。此外，以150 g/L 的细胞添加质量浓度作为催化酶源，不仅可实现较高的底物转化率，而且菌体量适中，能有效控制催化反应成本。因此，细胞添加质量浓度定为150 g/L。

温度是全细胞催化反应中较为重要的因素之一，温度既可以影响酶蛋白空间结构又决定着各中间产物的活化状态，从而显著影响酶的催化活性和反应速率[32]。本实验中，以重组菌株CW17 为催化酶源，添加质量浓度为150 mg/L，分别在35、40、45、50、55、60 ℃下进行全细胞催化，结果见图5b。从图5b 可以看出，重组菌株CW17 可适应的催化温度范围较广，且当催化温度由35 ℃逐步升高至60 ℃时，脱氧胸苷的转化率呈现出先升高后下降的趋势。当反应温度为50 ℃时，dA 的产量最高，为200.3 g/L，底物脱氧胸苷转化率为96.6%。

3 结论

本文将E. coli 来源的核苷磷酸化酶PyNP1 和PNP3 在B. subtilis 中异源表达，获得的重组菌株CW3 在全细胞催化2 h 后dA 的产量为113.1 g/L，脱氧胸苷转化率为54.5%。随后，通过RBS 序列优化策略，并利用互作短肽构建多酶复合物进一步提高了dA 的产量与底物转化率。在此基础上，对催化体系中细胞添加质量浓度及催化反应温度进行了优化，结果表明，当重组菌株CW17 细胞添加质量浓度为150 g/L，催化反应温度为50 ℃时，dA 的产量达到200.3 g/L，底物脱氧腺胸苷的转化率为96.6%。本研究为dA 的绿色高效生产奠定了良好的基础。

参考文献：

[1] FOX I H, KELLEY W N.The role of adenosine and 2′-deoxyadenosine in mammalian cells[J].Biochemistry of Review Annual, 1978, 47(1): 655-686.

[2] ULLMAN B, CLIFT S M, GUDAS L J, et al.Alterations in deoxyribonucleotide metabolism in cultured cells with ribonucleotide reductase activities refractory to feedback inhibition by 2′-deoxyadenosine triphosphate[J].Journal of Biological Chemistry, 1980, 255(17):8308-8314.

[3] GENINI D, ADACHI S, CHAO Q, et al.Deoxyadenosine analogs induce programmed cell death in chronic lymphocytic leukemia cells by damaging the DNA and by directly affecting the mitochondria[J].Blood, 2000, 96(10): 3537-3543.

[4] CAMAIONI E, BOYER J L, MOHANRAM A, et al.Deoxyadenosine bisphosphate derivatives as potent antagonists at P2Y1 receptors[J].Journal of Medicinal Chemistry, 1998, 41(2):183-190.

[5] KNIES C, REUTER H, HAMMERBACHER K, et al.Synthesis of new potential lipophilic co-drugs of 2-chloro-2′-deoxyadenosine(Cladribine, 2-CdA, Mavenclad®, Leustatin®) and 6-azauridine (z6U)with valproic acid[J].Chemistry & Biodiversity, 2019, 16(3):e1800497.

[6] FUKUSHIMA M, SUZUKI N, EMURA T, et al.Structure and activity of specific inhibitors of thymidine phosphorylase to potentiate the function of antitumor 2′-deoxyribonucleosides[J].Biochemical Pharmacology, 2000, 59(10): 1227-1236.

[7] PLOSCHIK D, RONICKE F, BEIKE H, et al.DNA primer extension with cyclopropenylated 7-deaza-2′-deoxyadenosine and efficient bioorthogonal labeling in vitro and in living cells[J].Chem Bio Chem, 2018, 19(18): 1949-1953.

[8] SHI S (时尚).Synthesis of 2′-dA derivatives[D].Yantai: Ludong University (鲁东大学), 2019.

[9] CARSON D A, WASSON D B, ESPARZA L M, et al.Oral antilymphocyte activity and induction of apoptosis by 2-chloro-2′-arabino-fluoro-2′-deoxyadenosine[J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 1992, 89(7): 2970-2974.

[10] GARG R, GUPTA S P, GAO H, et al.Comparative quantitative structure-activity relationship studies on anti-HIV drugs[J].Reviews Chemical, 1999, 99: 3525-3601.

[11] MICHAILIDIS E, MARCHAND B, KODAMA E N, et al.Mechanism of inhibition of HIV-1 reverse transcriptase by 4′-ethynyl-2-fluoro-2′-deoxyadenosine triphosphate, a translocation-defective reverse transcriptase inhibitor[J].Chemistry Biological of Journal,2009, 284(51): 35681-35691.

[12] DE CLERCQ E.Highlights in the discovery of antiviral drugs: A personal retrospective[J].Chemistry Medicinal of Journal, 2010,53(4): 1438-1450.

[13] FLIEGERT R, BAUCHE A, PEREZ A M W, et al.2′-Deoxyadenosine 5′-diphosphoribose is an endogenous TRPM2 superagonist[J].Biology Chemical Nature, 2017, 13(9): 1036-1044.

[14] LIU L, ZHOU M, PAN J.Composite hydrogel microspheres encapsulating hollow mesoporous imprinted nanoparticles for selective capture and separation of 2′-deoxyadenosine[J].Molecules 2022, 27: 7444.

[15] KAZIMIERCZUK Z, COTTAM H B, REVANKAR G R, et al.Synthesis of 2′-deoxytubercidin, 2′-deoxyadenosine, and related 2′-deoxynucleosides via a novel direct stereospecific sodium salt glycosylation procedure[J].Journal of the American Chemical Society, 1984, 106(21): 6379-6382.

[16] ZHAO H E (赵洪娥), CUI L (崔励).The purification of 2′-deoxyadenosine by crystallization[J].Journal of Dalian Polytechnic University (大连工业大学学报), 2012, 31(2): 115-117.

[17] KOMATSU H, AWANO H, ISHIBASHI H, et al.Development of chemo-enzymatic process and manufacture of deoxynucleosides[C]//Nucleic Acids Symposium Series.Oxford University Press, 2001,1(1): 49-50.

[18] LU Y C (路有昌), ZHANG H P (张换平).Synthesis of 2′-deoxyadenosine[J].Applied Chemical Industry (应用化工), 2006,35(7): 564-565.

[19] JIANG Z L (蒋忠良), LI Q K (李乾坤), QI X B (齐湘兵), et al.Synthesis research of 2′-deoxyadenosine[J].Journal of Tongji University: Natural Science (同济大学学报: 自然科学版), 2007,(9): 1264-1268.

[20] WANG J K (王建琨).Synthesizing 2′-deoxyadenosine by microbial transformation method[D].Xinxiang: Henan Normal University (河南师范大学), 2011.

[21] FERNANDEZ-LUCAS J, CONDEZO L A, QUEZADA M A, et al.Low-temperature synthesis of 2′-deoxyadenosine using immobilized psychrotrophic microorganisms[J].Biotechnology & Bioengineering,2008, 100(2): 213-222.

[22] CARDINAUD R, HOLGUIN J.Nucleoside deoxyribosyltransferase-Ⅱ from Lactobacillus helveticus substrate specificity studies pyrimidine bases as acceptors[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Enzymology, 1979, 568(2): 339-347.

[23] FERNANDEZ-LUCAS J, CONDEZO L A, MARTINEZ-LAGOS F,et al.Synthesis of 2′-deoxyribosylnucleosides using new 2′-deoxyribosyltransferase microorganism producers[J].Enzyme and Microbial Technology, 2007, 40(5): 1147-1155.

[24] HONG Y H (洪云海), DING Q B (丁庆豹), OU L (欧伶), et al.Enzymatic synthesis of 2′-deoxyadenosine by Brevibacterium acetylium[J].Industrial Microbiology (工业微生物), 2006, (1): 30-33.

[25] LIU G S (刘国生), CHEN L (陈琳), XING S T (邢善涛), et al.Synthesis of β-2′-deoxyadenosine from β-2′-deoxythymidine by immobilized cells[J].Chinese Journal of Biochemical and Pharmaceuticals, 2012, 33(5): 563-567.

[26] LIANG S H, LI W Z, GAO T, et al.Enzymatic synthesis of 2′-deoxyadenosine and 6-methylpurine-2′-deoxyriboside by Escherichia coli DH5α overexpressing nucleoside phosphorylases from Escherichia coli BL21[J].Journal of Bioscience and Bioengineering, 2010,110(2): 165-168.

[27] DRENICHEV M S, OSLOVSKY V E, ZENCHENKO A A, et al.Comparative analysis of enzymatic transglycosylation using E. coli nucleoside phosphorylases: A synthetic concept for the preparation of purine modified 2′-deoxyribonucleosides from ribonucleosides[J].International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(5): 2795.

[28] LIU X D (刘袖洞), WU C K (吴春凯), PEI J (裴婕).Research progress of cell immobilization catalysis in fine chemicals production[J].Fine Chemicals (精细化工), 2022, 39(4): 657-664, 805.

[29] WU Y, CHEN T, LIU Y, et al.Design of a programmable biosensor-CRISPRi genetic circuits for dynamic and autonomous dual-control of metabolic flux in Bacillus subtilis[J].Research Acids Nucleic,2020, 48(2): 996-1009.

[30] KANG W, MA T, LIU M, et al.Modular enzyme assembly for enhanced cascade biocatalysis and metabolic flux[J].Nature Communications, 2019, 10: 4248.

[31] WAN L, ZHU Y, CHEN G, et al.Efficient production of 2′-fucosyllactose from L-fucose via self-assembling multienzyme complexes in engineered Escherichia coli[J].ACS Synthetic Biology, 2021,10(10): 2488-2498.

[32] PAN X R (潘鑫茹), LIU J Z (刘均忠), ZHANG H J (张宏娟), et al.Synthesis of L-theanine by whole cell catalyst co-expressing PPK and GMAS[J].Fine Chemicals (精细化工), 2019, 36(9): 1827-1832.