半乳糖氧化酶模型化合物对乙苯选择性氧化制备苯乙酮的催化性能及机理
《精细化工》
2024年 41卷
第11期
20231011
中图分类号：TQ244.2
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摘要
温和条件下实现C—H 键的选择性氧化在精细化学品的生产中发挥着重要的作用。受半乳糖氧化酶的活性中心结构和催化循环启发，合成了模型化合物N,N'-双(2-羟基-3,5-二叔丁基苯基)-2,2'-二氨基联萘合铜〔CuL，L=N,N'-双(2-羟基-3,5-二叔丁基苯基)-2,2'-二氨基联萘〕。以CuL 为催化剂、N-羟基邻苯二甲酰亚胺（NHPI）为助催化剂，考察了乙苯选择性氧化制备苯乙酮的催化性能，并探讨了可能的反应机理。结果表明，在温和条件下（初始O 1.0 MPa、75 ℃、反应时间8 h），乙苯转化率可达99%，苯乙酮选择性可达99%。CuL 与NHPI 形成了活性中间体，通过电子转移，高效促进了NHPI 生成邻苯二甲酰亚胺-N-氧基（PINO）自由基，从而实现了乙苯C—H 键的活化。由动力学同位素效应实验推测，NHPI 的活化可能为决速步骤（NHPI 和氘代NHPI 的反应速率比值约为3.4）。电子顺磁共振和高分辨质谱结果表明，反应过程中存在烷基自由基、过氧自由基和羟基自由基。
关键词: 半乳糖氧化酶 仿生催化 乙苯 自由基 氧化 精细化工中间体
C—H 键的选择性氧化是合成树脂、农药、染料、涂料、纤维、医药中间体、功能添加剂、香精香料等各类精细有机化工产品的基本化学反应，受到广泛关注 。乙苯氧化产物苯乙酮是有机合成的重要中间体，也常用作溶剂，具有沸点高和稳定性好等特点。然而，鉴于精细化学品丰富的官能团和复杂性，实现区域和化学选择性氧化仍是一个重大的挑战 。这主要由于烃类物质的C—H 键具有较高的键能（355.6～439.3 kJ/mol），处于化学惰性状态，在室温下的自氧化反应缓慢，难以满足化工生产要求，而在高温下又容易导致选择性变差，甚至过氧化为CO 2 和H 2 O 。因此，面对日益趋紧的环境资源约束，顺应技术进步趋势，开发新的安全、绿色、可持续、高选择性的氧化工艺，具有迫切的现实需求。
半乳糖氧化酶（GOase）是一种广泛存在于真菌体中的单核铜氧化酶，其活性中心为可得失电子的单核铜和酪氨酰自由基配体 。Salen 型配合物通常以GOase 为仿生对象，中心金属Cu 的配位特点为2 个N 原子和2 个O 原子，配体为可逆动态的亚胺键（—C==N—），能够模拟GOase 具有单电子转移功能的酪氨酰自由基配体。使用氧化还原性配体，已合成了一些GOase 的模型化合物 ，并研究其结构和活性的关系。例如：KITAJIMA等 报道了Salen 型配合物作为GOase 的有效模型化合物，CHAUDHURI 等 合成了一种单核Cu Ⅱ -苯氧基配合物。这些模型配合物以O 2 为氧化剂，在温和条件下可将一级醇或二级醇氧化为相应的醛酮（ 图1 a）。但是，GOase 模型化合物无法实现烷烃的高效氧化。而GOase 催化循环夺取O—H 键中的H 原子，并活化O 2 为H 2 O 2 的过程值得关注。
图1 GOase 氧化醇可能的反应机理（a）及GOase 模型化合物与NHPI 组成的仿生催化体系（b）
N -羟基邻苯二甲酰亚胺（NHPI）是一个高效、低成本的氮氧自由基前驱体，广泛用于碳氢化合物的需氧氧化过程中 [11-13] 。由于NHPI 存在分子内氢键，较高的O—H 键解离能（～368.2 kJ/mol） 与大多数烷烃C—H 键解离能（355.6～418.4 kJ/mol） 匹配度相对较高，因此，通过O—H 键均裂生成的邻苯二甲酰亚胺- N -氧基（PINO）自由基能通过氢转移（HAT）路径夺取底物C—H 键中的H 原子，生成高活性的碳中心自由基，实现底物C—H 键的活化 。随后，碳中心自由基与O 2 结合，进一步得到氧化物种（ 图1 b）。因此，作为反应的引发步骤，PINO 自由基的高效引发、再生和循环是构筑高效催化体系的关键。
ISHII 等 创新性地将NHPI 与金属盐结合用于氧化异丁烷（100 ℃）；YAN 等 开发了PdCl 2 /NHPI体系用于C sp 2 —H 键的羟基化反应；MO 等 开发了电化学活化NHPI 方法；ZHANG 等 通过 α -Fe 2 O 3 和NHPI 在455 nm 光照条件下原位生成长效的PINO 自由基；MA 等 报道了FeO x /沸石催化剂在光照射下可以强化PINO 自由基的形成；WANG 等 报道了NHPI 催化氧化环己烷生成 ε -己内酯。然而，PINO 自由基很容易在高温和碱性条件下自分解 。此外，活化NHPI 到PINO 自由基的引发时间长、存在时间短，也限制了其应用 。
受GOase 氧化醇羟基催化循环的启发，本文拟将GOase 模型化合物活化NHPI 的O—H 键生成PINO 自由基，并用于碳氢化合物C sp 3 —H 键的氧化反应。GOase 模型化合物具有较强的夺H 能力，NHPI 能够在温和条件下高效活化为PINO 自由基，从而在较低温度下获得乙苯氧化较高的转化率和产物选择性。此反应体系中的自由基物种在温和条件下被快速引发、积累并持续整个反应过程。
1 方法
1.1 试剂与仪器
NHPI，工业级，华威瑞科化工有限公司；5,5-二甲基-1-吡咯啉- N -氧化物（DMPO），AR，日本同仁化学研究所；3,5-二叔丁基邻苯二酚、1,1'-联萘-2,2'-二胺、无水醋酸铜〔Cu(OAc) 2 〕、醋酸铜一水合物〔 Cu(OAc) 2 ·H 2 O 〕、 醋酸钴四水合物〔 Co(OAc) 2 ·4H 2 O 〕、 硝 酸 铁 九 水 合 物〔Fe(NO 3 ) 3 ·9H 2 O〕、乙酰丙酮锰(Ⅲ)〔Mn(acac) 3 〕、三乙酰丙酮铁(Ⅲ)〔Fe(acac) 3 〕、醋酸锌〔Zn(OAc) 2 〕、醋酸锰〔Mn(OAc) 2 〕、苯乙酮、1-苯乙醇、乙腈、其他试剂，AR，安耐吉化学 3A（安徽泽升科技有限公司）；O 2 （体积分数99.999%），广州气体有限公司。
GC-2010Plus 型气相色谱仪、GCMS-QP2010-Ultra型气相色谱-质谱联用仪（EPR），日本Shimadzu 公司；JESFA-200 型电子顺磁共振波谱仪，日本电子株式会社；UltrafleXtreme 型基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（ITMS），德国Bruker 公司；Avance NEO 400 MHz 型核磁共振谱仪、UltrafleXtreme™型MALDI-TOF 质谱仪，德国Bruker 公司；100 mL 不锈钢反应釜，江苏省镇江市丹徒环球机械配件厂。
1.2
按文献[25]合成配体H 2 L，并略作修改。合成路线如下所示：
将1.42 g（5 mmol）1,1'-联萘-2,2'-二胺和2.22 g（10 mmol）3,5-二叔丁基邻苯二酚加入到装有20 mL乙酸的三颈烧瓶中，常温下1,1'-联萘-2,2'-二胺在乙酸中溶解性较差，加热回流后完全溶解，溶液由橙色变为墨绿色，用薄层色谱法〔 V (石油醚)∶ V (乙酸乙酯)=6∶1〕监测反应进程，反应30 min 后结束，冷却至室温，有固体析出，过滤，用10 mL 乙酸进行洗涤，得到3.28 g 粉白色固体，产率87%。 1 HNMR(400 MHz, CDCl 3 ), δ : 1.22 (s, 18H), 1.42 (s, 18H),6.47 (br, 2H), 6.94 (d, 2H), 7.07 (d, 2H), 7.21 (d, 2H),7.31～7.41 (m, 6H), 7.84～7.90 (m, 4H)。ITMS,C 48 H 56 N 2 O 2 , m / Z : [M+H] + 实测值（计算值）693.88(692.97); [M+Na] + 实测值（计算值）715.77 (714.76)。FTIR (KBr), ν /cm -1 : 3425, 3376, 3345, 3058, 2960,2906, 2867, 2632, 1918, 1710, 1619, 1596, 1510, 1477,1419, 1363, 1224, 1147, 1116, 1025, 925, 879, 817,794, 750, 686, 647, 630, 578, 518, 480, 435, 416。
1.3 模型化合物
按文献[25]合成CuL，并略作修改。其合成路线如下所示：
取1.38 g（2 mmol）配体H 2 L 溶于装有10 mL无水甲醇的圆底烧瓶中，向其加入0.36 g（2 mmol）无水醋酸铜，在空气中搅拌30 min 后，反应液呈墨绿色，内含大量的不溶物，过滤，用甲醇、乙醚洗涤，干燥后得到墨绿色固体1.23 g，产率82%。MALDI-TOF, C 48 H 52 CuN 2 O 2 , m/Z : 实测值（计算值）751.44 (751.48)。FTIR (KBr), ν /cm -1 ：3436, 3270,3062, 2952, 2904, 2867, 1945, 1916, 1756, 1619, 1594,1510, 1479, 1427, 1386, 1359, 1301, 1234, 1207, 1147,1112, 1076, 1027, 1006, 991, 960, 931, 894, 863, 815,775, 742, 694, 632, 582, 568, 545, 509, 464, 447, 416。
1.4 结构表征与性能测试
1.4.1 表征方法
EPR 测试：将CuL、NHPI、底物和溶剂等加入到高温反应釜中，充入O 2 或氩气后，加热至目标温度。随后，在探测时间点通过取样阀取200 μL 反应液，加入20 μL 自由基捕获剂DMPO 充分混匀，注入扁平池中，用电子顺磁共振波谱仪进行测试。测试参数为：微波频率9.22 GHz，调制幅度0.1 mT，调制频率100 kHz，功率0.5 mW，时间常数0.03 s。
GC-MS 测定：GCMS-QP2010 Ultra 气相色谱-质谱仪配置Rtx-5 毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）和FID 检测器。测试升温程序为：初始温度50 ℃，平衡时间1 min，以10 ℃/min 的速率升温至100 ℃，保留2 min；以10 ℃/min 的速率升温至150 ℃，保留2 min；以20 ℃/min 的速率升温至250 ℃，保留2 min。
GC 测定：GC-2010Plus 气相色谱仪配置Inertcap Pure-Wax 毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）和氢火焰离子化（FID）检测器。测试升温程序为：初始温度50 ℃，平衡时间1 min，以10 ℃/min 的速率升温至160 ℃，保留1 min；以10 ℃/min 的速率升温至180 ℃，保留3 min。
1.4.2 性能测试
在乙苯5 mmol、催化剂用量（以乙苯物质的量计，下同）为0.2%、NHPI 用量为4%（以乙苯物质的量计，下同）、乙腈10 mL、初始O 2 压力1.0 MPa、75 ℃、反应时间8 h 的条件下，探究不同金属盐作为催化剂对反应的影响。
定性分析：采用商业样品作为GC-MS 或GC的标准品，通过对比保留时间以及质谱数据库定性分析。
定量分析：采用标准曲线气相色谱法（氯苯内标）测定转化率和收率。底物转化率、产物选择性按式（1）和（2）进行计算：
式中： A 0 为底物的加入量，mmol； A 1 为反应后的底物量，mmol； P N 为反应液中某产物的量，mmol； P 为所有产物的量，mmol。
1.4.3 自由基模拟解析方法
自由基物种的解析使用软件EasySpin 5.2.35 对连续波EPR 谱进行拟合 。
2 结果与讨论
2.1 乙苯氧化反应条件的考察
2.1.1 不同催化剂对乙苯氧化反应的影响
按照1.4.2 节实验条件，探究不同金属盐作为催化剂对乙苯氧化反应的影响，结果见 表1
表1 不同催化剂对乙苯氧化反应的影响
由 表1 可知，当Cu(OAc) 2 ·H 2 O 为催化剂时，具有较好的催化效果，乙苯转化率可达到88%，氧化产物苯乙酮选择性可达到98%；Co(acac) 2 为催化剂时， 乙苯转化率为 82% ， 相比经典的Co(OAc) 2 ·4H 2 O-NHPI 体系有一定的提升作用 ，可能是乙酸根对氧化反应有负面作用；其他铁盐和锰盐的催化效果均不佳；而价态难以发生变化的二价锌盐催化效果最为有限，乙苯转化率仅为21%。而合成的CuL 在相同的条件下则可以使乙苯转化率和产物苯乙酮选择性均达到99%，表明仿生半乳糖氧化酶活性中心结构的模型化合物CuL 具有优异的催化效果。
2.1.2 温度对乙苯氧化反应的影响
其他反应条件同1.4.2 节，以CuL 为催化剂，考察温度对乙苯氧化反应的影响，结果见 图2 。由 图2 可知，反应温度为45 ℃时，苯乙酮选择性为90%，但乙苯转化率仅为26%，表明CuL 可以在较低的温度下启动反应，可能源自仿生结构的特异性，能够在温和的条件下实现NHPI 的活化。当反应温度上升至60 ℃时，乙苯转化率大幅上升，达到91%，苯乙酮选择性为98%。反应温度提高至75 ℃时，CuL 催化乙苯氧化的转化率和产物苯乙酮选择性均为99%。进一步提高反应温度至90 ℃时，乙苯转化率和产物选择性变化不大，因此，75 ℃作为适宜温度。
图2 温度对乙苯氧化反应的影响
2.1.3 反应时间对乙苯氧化反应的影响
其他反应条件同2.1.2 节，75 ℃下考察反应时间对乙苯氧化反应的影响，结果见 图3
图3 反应时间对乙苯氧化反应的影响
由 图3 可知，CuL-NHPI 体系催化乙苯氧化表现出典型的自由基反应特征，在反应开始前0.5 h 存在短暂的诱导期；反应1 h 时，反应速率显著增快;反应2 h 时，乙苯转化率＞80%；在反应后半程，由于乙苯浓度降低，转化速率相应降低。反应过程中苯乙酮选择性始终维持在90%以上；反应4 h，乙苯的转化率可达94%；反应8 h 时，乙苯转化率和苯乙酮选择性均达到99%。因此，8 h 为合适的反应时间。
2.1.4 催化剂用量对乙苯氧化反应的影响
其他反应条件同2.1.3 节，在反应时间为8 h 的条件下考察催化剂用量对乙苯氧化反应的影响，结果见 表2
表2 催化剂用量对乙苯氧化反应的影响
由 表2 可知，当不加CuL 仅有NHPI 时，乙苯转化率仅为27%，苯乙酮选择性也相对较低（82%），说明没有催化剂活化NHPI 时催化活性不高；加入CuL 用量为0.01%时，乙苯转化率大幅上升至61%，同时苯乙酮选择性也升至94%，表明CuL 起到了实质性的催化作用；将CuL 用量增加至0.1%和0.2%时，乙苯转化率可达97%和99%，产物选择性在98%和99%；进一步将CuL 用量提升至0.4%时，对反应的影响不大。考虑到经济性，CuL 用量为0.1%～0.2%为适宜。
2.1.5 NHPI 用量对乙苯氧化反应的影响
其他反应条件同2.1.4 节，在CuL 用量为0.2%的条件下考察NHPI 用量对乙苯氧化反应的影响，结果见 表3
表3 NHPI 用量对乙苯氧化反应的影响
由 表3 可知，当不加入NHPI 仅加入CuL 时，乙苯氧化反应无法发生，说明NHPI 活化生成的PINO 自由基对于活化乙苯C—H 键起到关键性作用；随着NHPI 用量的增加，乙苯转化率逐渐上升；当NHPI 用量为4%和6%时，乙苯转化率几乎不变；而NHPI 用量对产物选择性的影响不大，因此，推测NHPI 仅在反应初始阶段对活化乙苯的C—H 键起到关键性作用。因此，NHPI 用量选择4%为宜。
2.1.6 反应压力对乙苯氧化反应的影响
其他反应条件同2.1.5 节，在NHPI 用量为4%的条件下，考察O 2 压力对乙苯氧化反应的影响，结果如 表4 所示。
表4 初始反应压力对乙苯氧化反应的影响
由 表4 可知，O 2 压力对反应影响较小，当压力为0.2～1.5 MPa 时，乙苯转化率为91%～99%，苯乙酮选择性没有明显变化。因此，此体系可以在较宽的压力范围内进行。
综合上述实验结果，在CuL 用量0.2%、NHPI用量4%、初始O 2 压力1.0 MPa、75 ℃、反应8 h的优化反应条件下，乙苯转化率高达99%，苯乙酮选择性高达99%。
2.2 反应机理探究
2.2.1 CuL 活化NHPI 分析
由于乙苯对PINO 自由基具有屏蔽作用，将底物更换为类似芳基烷烃结构的茚满进行 CuL 与NHPI 作用探究，结果见 图4 。混合CuL、NHPI 及茚满在O 2 气氛下加热，随后进行EPR 测试，检测到PINO 自由基〔超精细耦合常数（ α ）， α N =4.9 G， α H =0.3 G， g =2.0045〕 的存在（ 图4 a），表明CuL能够活化NHPI 生成PINO 自由基。当EPR 实验在Ar 气氛下进行时，检测到一个有机自由基信号（ α N =3.1 G， α H =3.6 G， g =2.0021），可能来源于NHPI与CuL 结合形成的配体自由基物种 （ 图4 b），表明NHPI 与CuL 之间发生了电子转移。将惰性气氛下的反应液进行质谱分析，得到了CuL 和NHPI 加合物的ESI-MS 谱图（ 图4 c），C 56 H 56 CuN 3 O 5 的 m / Z ：913.3506（实验值）；913.3510（计算值），进一步表明，CuL 和NHPI 发生了相互作用，生成PINO 自由基。
图4 PINO 自由基（a）、CuL 配体自由基（b）的EPR谱图及CuL-PINO 中间体的实验和模拟质谱（c）
2.2.2 自由基物种分析
CuL-NHPI 催化乙苯氧化反应具有明显的引发期，经历快速反应阶段，表现出典型的自由基反应特征。将CuL、NHPI 和乙苯在O 2 气氛下，使用自由基捕获剂DMPO 测试，得到的EPR 谱如 图5 a 所示。
图5 CuL 催化乙苯氧化反应的EPR 实验及模拟谱图（a）、反应中的自由基物种（b）
通过模拟解析得知，反应体系中存在过氧自由基（ROO·）（ α N =14.5 G， α H =11.2 G， g =2.0061）、烷基自由基（碳中心自由基）（ α N =16.0 G， α H =20.0 G， g =2.0056）和·OH（ α N =14.8 G， α H =14.8 G， g =2.0059） 。进一步的质谱测试表明，这些自由基物种分别归属于DMPO 捕获的乙苯氧化中间体，包括DMPO-EB（ m / Z ：218.1538）、DMPO-OOEB（ m / Z ：250.1438）、DMPO-OEB（ m / Z ：234.1485）和DMPO-OH（ m / Z ：130.0861）（ 图5 b）。其中，在反应溶液中检测到的·OH 可能为1-苯乙基过氧化氢分解产生 。
2.2.3 自由基动力学分析
时间分辨的自由基动力学分析结果见 图6
图6 时间分辨的CuL-NHPI 催化乙苯氧化反应的EPR谱图
由 图6 可知，CuL-NHPI 体系仅需30 min 即可生成并累积较多的自由基物种，反应360 min 仍能够维持较高的自由基浓度，表明CuL-NHPI 体系对自由基物种的引发、循环和再生具有促进作用。将乙苯转化的宏观动力学与自由基动力学结合发现，反应的引发期与自由基生成期相对应（0～60 min），快速反应阶段时自由基维持在一定的浓度，涉及自由基物种的快速转变与再生。因此，自由基物种的快速引发、再生和循环对反应的快速进行起到重要作用。
2.2.4 动力学同位素效应（KIE）分析
为了探究反应的决速步骤，进行了动力学同位素实验，结果见 图7
图7 动力学同位素效应实验
由 图7 可知，以NHPI 和氘代NHPI（NHPI- d ）为对比，苯乙酮的产量为参照，得到该反应的KIE值（KIE= K H /K D ，其中， K H 、 K D 分别代表NHPI 和NHPI- d 的反应速率）约为3.4，表明NHPI 脱氢活化为PINO 自由基可能为反应的决速步骤 。因此，NHPI 为催化剂的体系关键在于将其高效活化为PINO 自由基，模型化合物CuL 具有优异的摄氢能力。因此，可能是此仿生体系具有高效反应效果的原因之一。
2.2.5 可能的反应机理
基于以上的实验和分析，CuL-NHPI 催化氧化乙苯可能的机理如 图8 所示。
图8 可能的反应机理
首先，CuL 与NHPI 结合形成中间体，得益于CuL 优异的摄氢能力，通过电子转移形成PINO 自由基和CuL 配体基自由基物种，进而与O 2 结合形成活性氧物种；随后，PINO 自由基和乙苯发生氢转移反应，产生碳中心自由基；碳中心自由基与O 2 迅速结合形成乙苯基过氧自由基；此后，乙苯基过氧自由基可以从乙苯（自氧化）或NHPI 分子中提取1 个氢原子生成1-苯乙基过氧化氢，其进一步分解得到苯乙酮和1-苯乙醇，1-苯乙醇进一步氧化得到苯乙酮。
CuL 活化NHPI 的过程与GOase 酶氧化醇的机理类似，CuL 被NHPI 还原，随后O 2 分子将被还原的CuL 氧化为初始状态，自身转变为活性氧物种。结合PINO 活化底物，此催化体系同时实现了底物C—H 键和O 2 分子的活化。
3 结论
本文开发了一种基于GOase 模型化合物CuL 和NHPI 催化乙苯高效选择性氧化制备苯乙酮的方法。该催化体系在初始O 2 压力1.0 MPa、75 ℃、反应8 h的温和条件下，乙苯转化率达99%，产物苯乙酮选择性高达99%。机理研究表明，仿生催化剂CuL 可以有效活化NHPI 生成PINO 自由基。同时，KIE 实验表明，NHPI 的活化可能是决速步骤。此外，反应过程中的自由基物种得到鉴定，时间分辨自由基动力学研究表明，自由基物种在此体系中得到了良好的引发、再生和循环，为仿生酶模型化合物催化氧化体系的构筑和机理研究提供了一定的借鉴。
