钛/铋氧化物纳米材料用于声动力/放射联合治疗肿瘤
《精细化工》
2024年 41卷
第12期
20231064
中图分类号：TB34
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摘要
以钛酸四丁酯和冰醋酸为原料，经水热反应制备了TiO 纳米晶体，其与Bi(NO) 反应得到BiO/TiO 纳米颗粒（BTH），BTH 经聚多巴胺（PDA）涂层包覆，得到了BTH@PDA 纳米颗粒（BTP）。通过TEM、XRD和XPS 对BTP 形貌和组成进行了表征，采用生物安全性实验、体外细胞毒性测试、体外细胞摄取和活性氧染色测试了BTP 的生物相容性、细胞毒性和活性氧生成能力。结果表明，BTP 呈梭形，最长边粒径(125.18±14.66) nm，Zeta 电位为(–4.17±0.33) mV；BTP 悬液在远高于正常治疗质量浓度（300 μg/mL）的条件下，对L929 细胞和4T1细胞无明显的毒性；BTP 能增强放疗的疗效，在超声和X 射线共同处理后，能将4T1 细胞的存活率降至34.3%，并能有效产生活性氧；4T1 细胞对BTP 的摄取具有时间依赖性，在12 h 时有最大摄取。
关键词: 纳米材料 金属氧化物 声动力治疗 放射治疗 联合治疗 生物工程
放疗是一种传统的癌症治疗方法，与化疗 和手术 一起作为主流的治疗方法，在临床得到了广泛的应用。然而，肿瘤组织对放射线的吸收效率不高 ，并且不同类型的肿瘤对于放射线的敏感性存在显著差异，严重影响放疗效果 。研究表明，高原子序数元素可以通过光电效应和康普顿效应来沉积X 射线的能量，并产生更多的光电子和俄歇电子等二次电子来损伤癌细胞 。为了满足肿瘤组织对于营养物质和氧气的旺盛需求，实体瘤内部的血管结构致密且弯曲，然而这些血管往往存在结构和功能异常，包括基底膜缺乏以及血管内皮不完整等，这种特点令增强渗透和滞留（EPR）效应得以发生 。此外，还有研究表明，粒径在100～200 nm 的纳米颗粒可以通过EPR 效应进入并富集于肿瘤部位，并且椭球状、圆柱状、盘状等形状的颗粒在肿瘤部位的积累效果更好 。因此，构建一种能够富集在肿瘤部位并且能增强放射线对肿瘤损伤的新型纳米材料将是提升放疗效果的有效方法。
与近红外光相比，超声具有更强的组织穿透能力，能够作用于组织深处的肿瘤。近年来，声动力治疗作为一种由超声介导的非侵入性疗法受到了人们越来越多的关注。一些小分子声敏剂，如原卟啉 [11-12] 、吲哚菁绿 [13-14] 、二氢卟吩e6 等可以在超声辐照的条件下产生活性氧（ROS），从而损伤肿瘤细胞。然而，小分子声敏剂往往存在光毒性和暗毒性的问题，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常组织产生毒害。针对上述问题，有学者发现，超声辐照可以引发钛氧化物发生电子-空穴分离，能够在水介质中产生ROS，曾被广泛用于光催化领域的钛氧化物 材料开始被研究人员重视，并被广泛应用于癌症的声动力治疗 [17-18] 。
为了增强放疗效果，并与声动力治疗相结合，本文拟使用二氧化钛（TiO 2 ）为核心以响应超声产生ROS，并在其表面沉积氧化铋（Bi 2 O 3 ），铋自身高原子序数元素的特点使其具备增强放射损伤的功能，制备了具有适当粒径的纳米材料，使其可以通过EPR 效应被动靶向至实体瘤，再通过多巴胺在弱碱性环境下的氧化自聚合行为，在纳米平台的表面涂覆一层聚多巴胺（PDA），以提高其在生理环境中的稳定性与安全性。通过透射电子显微镜（TEM）、X 射线衍射仪（XRD）、X 射线光电子能谱仪（XPS）等表征纳米平台，并评估其对正常细胞的安全性以及对肿瘤细胞的杀伤能力。以期为增强放疗效果纳米材料的制备和声动力治疗的应用提供参考。
1 实验部分
1.1 试剂、材料与仪器
钛酸四丁酯（TBT）、冰醋酸、浓硝酸（质量分数68.0%）、尿素、无水乙醇，AR，国药集团化学试剂有限公司；Bi(NO 3 ) 3 ，AR，上海易恩化学技术有限公司；盐酸多巴胺，AR，阿拉丁试剂（上海）有限公司；盐酸阿霉素（HCl•DOX），AR，上海迈瑞尔化学技术有限公司；Tris-HCl 缓冲液（pH＝8.5），上海麦克林生化科技股份有限公司；RPMI 1640 培养基、DMEM 高糖培养基，美国Cytiva 公司；磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4）、青霉素-链霉素双抗溶液、胰蛋白酶（含酚红）、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液、2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）试剂盒、多聚甲醛组织固定液（质量浓度40 g/L），北京兰杰柯科技有限公司；胎牛血清（FBS），美国Merck 公司；Calcein-AM/PI 试剂盒，上海贝博生物科技有限公司；L929 细胞和4T1 细胞，赛百慷（上海）生物技术股份有限公司。
JEM-2100 型透射电子显微镜（TEM），日本JEOL；Zetasizer Nano ZS90 型纳米粒度及Zeta 电位分析仪，英国Malvern 公司；D8 Avance 型X 射线衍射仪（XRD），德国Bruker 公司；EscaLab 250Xi型X 射线光电子能谱仪（XPS）、Multiskan FC 型酶标仪，美国 Thermo Fisher Scientific 公司；WED-100 型超声理疗仪，深圳市威尔德医疗电子有限公司；FV1000 型激光共聚焦扫描电子显微镜（CLSM），日本Olympus 公司；DMi8 型倒置荧光显微镜，德国Leica 公司。
1.2 方法
1.2.1 TiO 2 纳米晶体制备
参考文献[19]方法制备TiO 2 纳米晶体。在30 mL冰醋酸中加入2 mL 的TBT，并在搅拌下迅速加入1 mL 去离子水，室温下搅拌10 min 后移入带有聚四氟乙烯内衬的水热釜中密封，然后将水热釜置于马弗炉中150 ℃加热12 h。反应结束后，待水热釜冷却至室温， 将反应混合物离心 10 min（13000 r/min），所得固体沉淀用去离子水和无水乙醇分别洗涤3 次，得到344.8 mg 白色TiO 2 纳米晶体。
1.2.2 Bi 2 O 3 /TiO 2 纳米颗粒制备
称取TiO 2 纳米晶体100 mg 分散在50 mL 去离子水中得到 TiO 2 悬液，接着在TiO 2 悬液中加入10 μL 浓硝酸和73 mg 的Bi(NO 3 ) 3 ，搅拌使其完全溶解。再向上述体系中加入1.2 g 尿素，升温至85 ℃加热6 h。待反应体系冷却至室温后，离心收集，得到白色沉淀，用去离子水和无水乙醇分别洗涤3 次后，在60 ℃烘箱中干燥12 h。最后将所得产物在500 ℃下煅烧3 h，得到117.4 mg 的Bi 2 O 3 /TiO 2 纳米颗粒，记为BTH。
1.2.3 PDA 涂层涂覆
首先，称取4 mg 盐酸多巴胺溶于Tris-HCl 缓冲液（pH=8.5）中，配成质量浓度为0.2 g/L 的溶液，记为溶液A。称取30 mg 的BTH 溶于30 mL 的Tris-HCl 缓冲液（pH=8.5）中，记为溶液B。然后，将20 mL 溶液A 以10 mL/h 的速率滴加至溶液B 中，并避光搅拌6 h。最后，经离心收集沉淀产物，并用去离子水洗涤3 次，–45 ℃冷冻干燥24 h 后，得到BTH@PDA纳米颗粒，记为BTP。其制备过程如下所示。
1.3 表征与测试
通过TEM 观察TiO 2 纳米晶体、BTH 和BTP 的微观形貌，通过Image J 进行粒径统计，测试工作电压200 kV。使用纳米粒度及Zeta 电位分析仪测定材料的Zeta 电位和粒径分布。XRD 测试：靶材Cu K α （ λ =0.1541 nm），管电压40 V，管电流40 mA，扫描速率8 (°)/min，扫描范围2 θ =3°～90°。通过XPS分析材料的元素组成，Al K α 为射线源，并以C 1 s （284.8 eV）为基准对数据进行校正。
1.4 体外细胞毒性测试
使用CCK-8 法测定不同材料以及不同治疗方法对4T1 细胞的毒性。首先，将4T1 细胞以1×10 4 个/孔的细胞密度接种于 96 孔细胞培养板中，使用RPMI1640 培养基培养24 h。将BTP 溶于RPMI1640培养基，配成不同质量浓度（0、3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 μg/mL）的悬液，待用。根据CCK-8试剂盒说明书，使用RPMI1640 培养基稀释CCK-8原液，配制成体积分数10%的CCK-8 工作液。
根据不同处理方法，将各实验组设置为：材料处理组（仅有不同质量浓度的BTP 培养基悬液）、超声处理组（不同质量浓度的BTP 培养基悬液+超声辐照）、放射处理组（不同质量浓度的BTP 培养基悬液+X 射线辐照）；共同处理组（不同质量浓度的BTP 培养基悬液+超声辐照+X 射线辐照）。对于材料处理组，首先吸弃旧培养基，向每孔中分别加入200 μL 不同质量浓度的BTP 悬液共孵育24 h 后，除去旧培养基，在每孔内加入110 μL 的CCK-8 工作液，避光孵育45 min 后使用酶标仪测定溶液的吸光度并根据公式（1）计算细胞的存活率；对于超声处理组，吸弃旧培养基并向每孔中分别加入200 μL不同质量浓度的BTP 悬液共孵育16 h 后，对细胞进行超声处理（1 MHz，2 W/cm 2 ，占空比40%，3 min），继续孵育8 h，随后除去旧培养基，在每孔内加入110 μL 的CCK-8 工作液，避光孵育45 min 后使用酶标仪测定溶液的吸光度并根据公式（1）计算细胞存活率；对于放射处理组，吸弃旧培养基并向每孔中分别加入200 μL 不同质量浓度的BTP 悬液共孵育16 h 后，对细胞进行X 射线照射，放射剂量为4 Gy，继续培养8 h，随后除去旧培养基，在每孔内加入110 μL 的CCK-8 工作液，避光孵育45 min 后使用酶标仪测定溶液的吸光度并根据公式（1）计算细胞存活率；对于共同处理组，吸弃旧培养基并向每孔中分别加入200 μL 不同质量浓度的BTP 悬液共孵育16 h 后，先对其进行剂量为4 Gy 的X 射线照射，随后立即进行超声处理（1 MHz，2 W/cm 2 ，占空比40%，3 min），继续培养8 h 后，随后吸弃旧培养基，在每孔内加入110 μL 的CCK-8 工作液，避光孵育45 min 后使用酶标仪测定溶液的吸光度并根据公式（1）计算细胞存活率 。各组设置为：实验组（材料处理组、超声处理组、放射处理组和共同处理组）、对照组（使用不含材料的培养基培养细胞且不施加任何处理，后用CCK-8 工作液与细胞共孵育）和空白组（仅有CCK-8 工作液）。
式中： A 0 、 A 1 、 A 2 分别代表空白组、实验组、对照组的吸光度。
1.5 生物安全性测试
选用L929 细胞和4T1 细胞为模型细胞，测试材料对于正常细胞和肿瘤细胞的毒性。将L929 细胞和4T1 细胞以1×10 4 个/孔的细胞密度接种于96 孔细胞培养板中。L929 细胞与4T1 细胞分别使用含有双抗（青霉素，100 U/mL；链霉素，100 g/L）的DMEM 高糖培养基与RPMI1640 培养基在恒温培养箱（37 ℃，CO 2 体积分数5%）中培养24 h 后，吸弃旧培养基，每孔分别加入预先配制的不同质量浓度（50、100、150、200、300 μg/mL）的BTP 培养基悬液200 μL（用于L929 细胞的BTP 悬液用DMEM高糖培养基配制，用于 4T1 细胞的 BTP 悬液用RPMI1640 培养基配制），继续孵育24 h。最后去除旧培养基，每孔加入CCK-8 工作液110 μL，避光孵育45 min，使用酶标仪测定实验组、对照组和空白组的吸光度，并按公式（1）计算细胞存活率。各组设置为：实验组（在使用含有BTP 的培养基悬液培养后用CCK-8 工作液与细胞共孵育）、对照组（使用不含材料的培养基培养细胞后用CCK-8 工作液与细胞共孵育）和空白组（仅有CCK-8 工作液）。
1.6 体外细胞摄取测试
使用常见化疗药物DOX 作为荧光标记。DOX在受到波长为490 nm 的激光激发时，在550 nm 处能够发出最大荧光。由于PDA 涂层表面带负电，与DOX 电性相反，因此，可以通过静电吸附的方式将DOX 负载在BTP 纳米颗粒表面。具体步骤为：各取2 mg 的BTP 与HCl•DOX 共溶于5 mL 去离子水中，避光搅拌24 h 后，以13000 r/min 的转速离心分离，去除未负载的游离DOX，随后用去离子水洗涤沉淀，并在–45 ℃冷冻24 h，得到BTP-DOX。将BTP-DOX 溶于RPMI1640 培养基，配成质量浓度为50 μg/mL 的BTP-DOX 悬液。
首先，将4T1 细胞以1×10 5 个/孔的细胞密度接种于玻底培养皿上，在恒温（37 ℃，CO 2 体积分数5%）培养箱中培养24 h，随后吸弃旧培养液，加入2 mL 的BTP-DOX 悬液共孵育不同时间（0、4、12、24 h）后，除去含有材料的培养液并用PBS 洗涤2次，之后使用多聚甲醛组织固定液避光固定细胞15 min，然后加入500 μL 质量浓度为10 μg/mL 的DAPI 染液，避光孵育5 min 后用PBS 洗涤2 次。最后使用CLSM 观察细胞内DOX 的荧光强弱。
1.7 ROS 染色测试
以1×10 5 个/孔的细胞密度将4T1 细胞接种在6孔细胞培养板上，并在 37 ℃恒温培养箱中培养24 h。将细胞分为4 组（对照组、BTP 组、超声组和BTP+超声组），首先，在除去旧培养基后，每孔内加入1 mL 对应的新培养基（对照组与超声组为RPMI1640 培养基，BTP 组与 BTP+超声组为RPMI1640 培养基配制的质量浓度为50 μg/mL 的BTP 培养基悬液）培养16 h 后，除去培养液，用PBS洗涤细胞2 次。根据DCFH-DA 试剂盒说明书，用无血清培养基稀释 DCFH-DA 原液，配成浓度为10 μmol/L 的工作液。对照组与BTP 组在每孔内加入工作液1 mL，在培养箱（37 ℃，CO 2 体积分数5%）中避光孵育30 min。超声组与BTP+超声组在加入工作液1 mL 后先避光孵育10 min，随后施加超声（1 MHz，2 W/cm 2 ，占空比40%，3 min），接着再避光孵育20 min。最后除去工作液，用无血清培养基润洗细胞2 次，使用倒置荧光显微镜观察各组细胞的荧光。
2 结果与讨论
2.1 表征结果分析
图1 为TiO 2 纳米晶体、BTH 和BTP 的TEM 图及粒径分布图。
图1 TiO
从 图1 a～d 可以看出，所制备的TiO 2 纳米晶体呈梭形，粒径为(89.09±14.00) nm（按照最长边计算）；负载Bi 2 O 3 后，BTH 粒径为(106.55±15.51) nm；包覆PDA 涂层后，BTP 表面可见一层明显的薄膜，厚度约为9 nm，整体粒径增大为(125.18±14.66) nm，表明PDA 成功包覆BTH。Zeta 电位测定结果显示，BTH 的表面Zeta 电位为(18.60±0.33) mV，而包覆PDA 涂层后 BTP 的表面 Zeta 电位为(–4.17±0.33) mV，这是因为，PDA 含有大量的羟基，导致BTP 的Zeta 电位从正值（BTH）变为负值。
图2 为BTH 的XRD 谱图。可以看出，BTH 由Bi 2 O 3 （Bi 2 O 3 ：PDF#76-2478）与锐钛矿型的TiO 2 （TiO 2 ：PDF#21-1272）组成，2 θ =25.3°、37.8°和48.0°的衍射峰分别属于TiO 2 的(101)、(004)和(200)晶面，2 θ =28.3°、47.1°和55.9°的衍射峰则属于Bi 2 O 3 的(111)、(220)和(311)晶面。
图2 BTH 的XRD 谱图
图3 为BTH 的XPS 谱图。可以看出，BTH 表面分布着O、Ti 和Bi 元素；Ti 2 p 在结合能458.7和464.6 eV 处峰分别属于Ti 2 p 3/2 和Ti 2 p 1/2 ；Bi 4 f 在结合能159.4 和164.6 eV 处峰分别属于Bi 4 f 7/2 和Bi 4 f 5/2 ，证明Ti 4+ 与Bi 3+ 的存在，与文献 [21-22] 结果一致。
图3 BTH 的XPS 谱图
2.2 体外细胞毒性分析
图4 a 为BTP 的体外细胞毒性测试结果。可以看出，在未经超声和X 射线辐照的条件下，不同质量浓度的BTP 均未明显影响4T1 细胞的存活；而经过超声处理或X 射线照射的细胞，细胞存活率分别下降至59.6%与64.7%；同时接受两种处理（超声和X射线照射）的4T1 细胞，其细胞的存活率降至34.3%，与BTP 单独处理组有极显著性差异（ P< 0.005），证明了声动力/放射联合治疗的策略是有效的。
图4 BTP 的细胞毒性（a）与生物安全性测试（b）
2.3 生物安全性分析
图4 b 为BTP 的生物安全性测试结果。可以看出，即使是在远高于正常治疗质量浓度的条件下（300 μg/mL），BTP 都没有对L929 细胞和4T1 细胞显示出明显的毒性，细胞存活率仍能达到95.2%（L929 细胞）与88.6%（4T1 细胞），表明BTP 具有良好的生物安全性。
2.4 细胞摄取结果分析
图5 为BTP-DOX 在不同时间下细胞摄取的CLSM 图。可以看出，在0～12 h 内细胞的红色荧光（DOX 标记的BTP）逐渐变强，之后（12～24 h）则慢慢减弱；而细胞的蓝色荧光（DAPI 染液染色的4T1 细胞的细胞核）未发生明显变化，说明4T1 细胞对BTP 颗粒的摄取具有时间依赖性，并且在12 h时有最大摄取。
图5 BTP-DOX 在不同时间的摄取情况
2.5 ROS 染色结果分析
ROS 探针DCFH-DA 是一种可以渗透细胞膜的小分子，在进入细胞后，会被细胞内的酯酶分解为本身不带荧光的DCFH 而失去透过细胞膜的能力，并滞留在细胞内，易被ROS 氧化为带有荧光的2′,7′-二氯荧光素，荧光的强弱可以反映所产生的ROS 的量。 图6 为不同处理组的细胞内ROS 产生情况。
图6 不同处理组的细胞内ROS 产生情况
从 图6 可以看出，只有BTP+超声组观察到绿色荧光，而在对照组、BTP 组和超声组中未观察到绿色荧光，表明体系中的ROS 主要来自于BTP 材料对超声的响应行为，说明BTP 材料本身在未受到超声辐照的情况下，并不能诱导ROS 的产生。
3 结论
以TBT 和冰醋酸为原料，经水热反应制备了TiO 2 纳米晶体，再与Bi(NO 3 ) 3 反应得到Bi 2 O 3 /TiO 2 纳米颗粒（BTH），最后经PDA 涂层包覆，得到BTH@PDA 纳米颗粒（BTP）。BTP 呈梭形，最长边粒径为(125.18±14.66) nm，Zeta 电位为(–4.17±0.33) mV。BTP 悬液在远高于正常治疗质量浓度的条件下（300 μg/mL），对L929 细胞和4T1 细胞无明显毒性。BTP 能够增强放疗的疗效，在超声和X射线共同处理后，4T1 细胞的存活率为34.3%，并能有效产生ROS。4T1 细胞对BTP 颗粒的摄取具有时间依赖性，并且在12 h 时有最大摄取。
BTP 表面的PDA 涂层在增强生物安全性的同时，其良好的黏附性也为负载更多化疗药物、光敏剂或靶向分子等提供了可能，作为联合治疗的纳米平台，具有进一步研究的价值。
