比率型过氧化氢荧光探针的合成及成像应用

胡 伟1，王旭梅2，柴 丽1，翟 浩3，宋新建2*

（1.忻州师范学院 化学系，山西 忻州 034000；2.湖北民族大学 生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000；3.山西惟健医疗科技有限公司，山西 忻州 034000）

摘要：以6-甲氧基苯并噻唑-2-羟基喹啉为双光子荧光团、硼酸酯为过氧化氢（H2O2）识别基团，合成了比率型检测H2O2 的双光子荧光探针{6-甲氧基-2-[6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)喹啉-2-基]苯并[d]噻唑}（MQH2O2）。利用1HNMR、13CNMR、HRMS 确定了其结构，利用荧光光谱和双光子荧光光谱对探针MQH2O2进行了H2O2 响应能力的评估。结果表明，探针MQH2O2 具有良好的H2O2 比率〔30 min 内比率（I535/I465，其中，I535 和I465 分别为波长为535 和465nm 处的荧光强度）响应信号比未加H2O2 增强约25.4 倍、检出限低至38.6 nmol/L〕和双光子性质（最大双光子荧光活性截面为150 GM）。通过双光子共聚焦成像完成了细胞和大脑组织成像。该探针能够实现脑卒中诱导细胞氧化应激的原位成像分析。

关键词：比率型荧光探针；过氧化氢；双光子激光共聚焦成像；脑卒中；氧化应激；功能材料

中图分类号：O657.3；R313

文献标识码：A

文章编号：1003-5214 (2023) 11-2421-09

收稿日期：2022-12-06; 定用日期：2023-04-17;

DOI: 10.13550/j.jxhg.20221116

基金项目：国家自然科学基金项目（22166017）

作者简介：胡 伟（1990—），男，讲师，E-mail：huwchem@163.com。联系人：宋新建（1975—），男，教授，E-mail：whxjsong@163.com。

Synthesis and imaging application of ratiometric fluorescent probe for hydrogen peroxide

HU Wei1, WANG Xumei2, CHAI Li1, ZHAI Hao3, SONG Xinjian2*

（1.Department of Chemistry, Xinzhou Normal University, Xinzhou 034000, Shanxi, China; 2. Hubei Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization, Hubei Minzu University, Enshi 445000, Hubei, China; 3. Shanxi Weijian Medical Technology Co., Ltd., Xinzhou 034000, Shanxi, China）

Abstract: Two-photon fluorescence probe, 6-methoxy-2-[6-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)quinolin-2-yl]benzo[d]thiazole (MQH2O2), was synthesized from 6-methoxybenzothiazol-2-hydroxyquinoline as fluorescence moiety and borate ester as hydrogen peroxide (H2O2) recognition moiety, and characterized by 1HNMR, 13CNMR and HRMS.The response sensitivity of MQH2O2 to H2O2 was evaluated by fluorescence spectroscopy and two-photon fluorescence spectroscopy.The results revealed that the probe MQH2O2 displayed good H2O2 ratio [(I535/I465, herein, I535 and I465 are fluorescence intensity at wavelength 535 and 465 nm, respectively) response enhancement of about 25.4-fold than that within 30 min and detection limit as low as 38.6 nmol/L] and proficient two-photon properties, with a maximum two-photon fluorescence active cross-section of 150 GM.Finally, data from cell and brain tissue analysis conducted by two-photon confocal imaging proved that the probe was capable of accomplishing in situ imaging analysis of oxidative stress caused by stroke.

Key words: ratiometric fluorescent probes; hydrogen peroxide; two-photon ratiometric fluorescence imaging; stroke; oxidative stress; functional materials

作为全球主要的疾病致死和致残因素之一，缺血性脑卒中现已获得广泛关注。H2O2 作为细胞氧化应激代谢产生的重要活性氧（ROS），在生命系统中发挥着重要的生理和病理作用[1-3]。KUMARI 等[4]和CHEN 等[5]研究发现，H2O2 在缺血性和出血性脑卒中的脑血管中产生，并参与脑卒中引起的脑损伤过程。因此，在体内和原位监测脑卒中疾病中脑组织微血管中的H2O2 对于脑卒中早期诊断和治疗具有重要意义。

双光子共聚焦成像技术作为现阶段最受欢迎的成像模式之一，不仅成像深度大，还具有背景荧光低、高时空分辨率以及光损伤小的特点[6-10]。近年来，研究发现，比率型荧光探针具有自校准能力，能够克服由激发光波动、探针浓度变化、不均匀分布和区室定位产生的基于强度的荧光探针的系统误差[11-12]。

为此，本文拟利用分子内电荷转移（ICT）机理设计一例用于检测H2O2 的比率型双光子荧光探针{6-甲氧基-2-[6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)喹啉-2-基]苯并[d]噻唑}（MQH2O2），MQH2O2 以6-甲氧基苯并噻唑-2-羟基喹啉为双光子荧光团，硼酸酯为H2O2 识别基团，用于细胞和小鼠大脑组织水平的成像，以期实现脑卒中诱导细胞氧化应激的精准原位成像。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

H2O2（质量分数30%）、双(频哪醇合)二硼、乙酸钾（KOAc）、1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯〔Pd(dppf)Cl2〕、三溴化硼（BBr3）、罗丹明6G、罗丹明B、噻唑蓝（MTT）、佛波酯（PMA）、N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）、Apocynin（APO），分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMEM 细胞培养基，Gibco 公司；PC12 细胞（肾上腺嗜铬细胞瘤细胞），厦门逸漠生物技术有限公司；C57BL/6 雄性小鼠，湖南斯莱克京达实验动物有限公司；柱层析硅胶（200～300 目），上海皓鸿生物医药科技有限公司；所有溶剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。所有试剂使用前未经进一步纯化，实验所需溶液均使用超纯水配制。

UV-2550 型紫外-可见分光光度计、RF-6000 型荧光分光光度计，日本Shimadzu 公司；LSM780 NLO型双光子激光共聚焦显微镜，德国Carl Zeiss 公司；6230 TOF 型电喷雾-高分辨时间质谱仪（ESI-TOF），美国Agilent 公司；Ascend 400 MHz 型核磁共振波谱仪，德国Bruker 公司；Vector 22 型傅里叶变换红外光谱仪、Multiskan FC 型酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 制备方法

1.2.1 2-氨基-5-甲氧基苯硫醇（Ⅰ）、6-溴-2-甲基喹啉（Ⅱ）和6-溴-2-甲醛基喹啉（Ⅲ）的制备化合物Ⅰ～Ⅲ制备过程参照文献[13]方法。

1.2.2 2-(6-溴喹啉-2-基)-6-甲氧基苯并[d]噻唑（Ⅳ）的制备

向 25 mL 单口圆底烧瓶中加入 468 mg（2.0 mmol）Ⅲ、236 μL（2.2 mmol）Ⅰ、5.0 mL二甲基亚砜（DMSO），升温至130 ℃反应2 h，薄层色谱法（TLC）〔展开剂 V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1 混合溶剂〕实时监测至反应完全。将反应液冷却至室温，二氯甲烷萃取，合并有机相并干燥12 h，减压浓缩，采用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=8∶1 混合溶剂为洗脱剂，柱层析分离得到白色固体200 mg，产率29%。熔点：101 ℃。1HNMR (400 MHz,DMSO-d6), δ: 8.19 (dd, J = 8.0、2.2 Hz, 1H), 8.08 (t,J = 2.2 Hz, 1H), 8.03 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.94 (d, J =8.2 Hz, 1H), 7.77 (dd, J = 8.3、1.9 Hz, 1H), 7.68 (d,J = 7.9 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.96 (dd, J =7.8、1.9 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H)。13CNMR (100 MHz,DMSO-d6), δ: 166.06, 156.73, 148.39, 148.02, 146.88,135.83, 134.98, 132.48, 129.96, 129.83, 129.80,122.87, 120.19, 116.13, 114.20, 107.34, 54.73。HRMS(ESI), C17H12BrN2OS+,m/Z: [M+H]+计算值370.9854；测试值370.9813。

1.2.3 化合物MQH2O2 的制备

将 200 mg（0.54 mmol）Ⅳ、280 mg（1.1 mmol）混合双(频哪醇合)二硼、100 mg（1.82 mmol）乙酸钾、39.51 mg（0.054 mmol）Pd(dppf)Cl2 和20 mL无水1,4-二氧六环置于50 mL 单口反应瓶中，升高温度至80 ℃，反应24 h，TLC〔展开剂V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1 混合溶剂〕实时监测，待原料点消失，停止反应，将反应液冷却至室温，减压浓缩，采用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=8∶1 混合溶剂为洗脱剂，柱层析分离得白色固体119 mg，产率60%。熔点：133～134 ℃。1HNMR (400 MHz, DMSO-d6), δ:8.69 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.50～8.35 (m, 2H),8.19～7.99 (m, 3H), 7.78 (s, 1H), 7.20 (d, J = 7.9 Hz,1H), 3.88 (s, 3H), 1.32 (s, 12H)。13CNMR (100 MHz,DMSO-d6), δ: 198.00, 155.75, 154.99, 153.95, 143.24,136.15, 128.45, 127.88, 123.76, 122.44, 121.41,119.89, 66.00, 47.19, 29.73, 26.96, 26.87。HRMS(ESI), C23H24BN2O3S+, m/Z: [M+H]+ 计 算 值419.1601；测 试 值 419.1643。FTIR (v/cm–1)：1250～1750（喹啉和苯并噻唑中C—N 键的伸缩振动）；1350～1310（硼酸酯中B—O 键的伸缩振动）；1225～1060（甲氧基中C—O—C 键的伸缩振动）。

1.2.4 2-[6-(苄氧基)喹啉-2-基]-6-甲氧基苯并[d]噻唑（Ⅷ）的制备

化合物Ⅴ～Ⅶ制备过程参照文献[14]方法。

向 25 mL 单口圆底烧瓶中加入 530 mg（2.0 mmol）Ⅰ、370 mg（2.4 mmol）Ⅶ和5.0 mL DMSO，升温至130 ℃反应2 h，TLC〔展开剂V(石油醚)∶V(乙酸乙酯) = 2∶1 混合溶剂〕实时监测至反应完全。将反应液冷却至室温，二氯甲烷萃取，合并有机相并干燥12 h，减压浓缩，采用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯) = 8∶1 混合溶剂为洗脱剂，用柱层析分离得淡黄色固体495 mg，产率63%。熔点：117 ℃。1HNMR (400 MHz, DMSO-d6), δ: 8.10 (dd,J = 8.0、2.3 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.87 (d,J = 8.1 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.56 (t, J =2.0 Hz, 1H), 7.42 (dd, J = 7.1、1.2 Hz, 2H), 7.37～7.27(m, 4H), 7.19 (dd, J = 8.2、1.8 Hz, 1H), 6.96 (dd, J =7.8、1.9 Hz, 1H), 5.07 (t, J = 1.0 Hz, 2H), 3.82 (s,3H)。13CNMR (100 MHz, DMSO-d6), δ: 166.06,156.73, 155.92, 148.39, 148.31, 143.56, 136.75,135.83, 134.73, 130.76, 130.14, 128.55, 128.38,128.23, 122.87, 120.22, 119.40, 114.20, 110.16,107.34, 70.18, 54.73。HRMS (ESI), C24H19N2O2S+,m/Z: [M+H]+计算值399.1167；测试值399.1179。

1.2.5 2-(6-甲氧基苯并[d]噻唑-2-基)喹啉-6-醇（MHQMB）的制备

在0 ℃下，向100 mL 单口烧瓶中加入20 mL无水二氯甲烷和520 mg（1.40 mmol）Ⅷ，并在搅拌条件下缓慢将5.20 mL 1 mol/L BBr3 的二氯甲烷溶液滴加至上述反应液中，升温至室温反应12 h，TLC〔展开剂V(石油醚)∶V(乙酸乙酯) = 2∶1 混合溶液〕实时监测至反应完全。冰水浴下缓慢加入过量的饱和NaHCO3 溶液将反应液调至中性，二氯甲烷萃取并干燥，减压旋干二氯甲烷，采用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯) = 6∶1 混合溶剂为洗脱剂，柱层析分离得黄色固体301 mg，产率71%。熔点：158～159 ℃。

1HNMR (400 MHz, DMSO-d6), δ: 8.38 (s, 1H), 8.06(dd, J = 7.9、2.1 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 7.8 Hz, 1H),7.83 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 7.9 Hz, 1H),7.34～7.28 (m, 2H), 7.13 (dd, J = 8.7、1.9 Hz, 1H), 6.96(dd, J = 7.8、1.9 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H)。13CNMR (100 MHz，DMSO-d6), δ: 166.06, 156.73, 155.76, 148.39,148.37, 142.44, 135.83, 134.46, 131.78, 131.19,122.87, 120.26, 119.89, 114.20, 111.88, 107.34,54.73。HRMS (ESI), C17H13N2O2S+, m/Z: [M+H]+计算值309.0698；测试值309.0679。FTIR (v/cm–1)：3607（O—H 键的伸缩振动）；1250～1750（喹啉和苯并噻唑中C—N 键的伸缩振动）；1225～1060（甲氧基中C—O—C 键的伸缩振动）。

目标化合物的合成路线如下所示。

1.3 双光子荧光活性截面

采用双光子诱导荧光法测定MQH2O2 在反应前后的双光子吸收截面。首先，以10 µmol/L 罗丹明B乙醇溶液为参比溶液，按式（1）计算探针MQH2O2及MHQMB 的荧光量子产率：

式中：ΦS 为量子产率；A 为最大吸收波长处的吸光度，A ≤ 0.05；n 为溶剂的折射率；F 为利用最大吸收波长激发后的荧光光谱积分面积；下标s、r 分别为待测样品和参比溶液；Φr 为罗丹明B 溶液（参比溶液）的量子产率（0.71）。

再以罗丹明6G 的甲醇溶液（5 µmol/L）为参比溶液，测定MQH2O2 与H2O2 反应前后在甲醇溶液中的双光子吸收截面δ（激发波长710～800 nm），再通过式（2）计算双光子荧光活性截面：

式中：δS 为双光子荧光活性截面，GM（1 GM = 1×10-50 cm4 s·photons-1·molecule-1）；S 为双光子荧光光谱积分面积；Φ 为量子产率；c 为溶液浓度，µmol/L；n 为溶剂的折射率；下标s、r 分别为待测样品和参比溶液；δr 为参比溶液罗丹明6G 在甲醇溶液中的双光子吸收截面，为70 GM。

1.4 生物模型的构建

1.4.1 细胞培养

将密度为1×106 个/mL PC12 细胞接种于含有体积分数为 1%青霉素和链霉素和 10%胎牛血清的DMEM 细胞培养基中，于37 ℃培养箱（体积分数为5% CO2、体积分数为95%空气）中培养。成像前一天将细胞转移至T25 细胞培养瓶中使其贴壁生长至适当密度。成像前使用磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH=7.4）将细胞清洗2 次，成像时使用双光子激发波长730 nm，荧光收集范围为420～480 nm（蓝色通道）及530～600 nm（绿色通道）。

1.4.2 细胞毒性实验

采用MTT 法测定MQH2O2的细胞毒性。将PC12细胞接种于96 孔板中（接种密度4.5×104 个/mL），将不同浓度MQH2O2（0、2、5、10、20、30 µmol/L）分别加到100 μL 含体积分数10% DMSO 的DMEM细胞培养基中（每个浓度设3 组平行实验）。将不同浓度MQH2O2 标记的PC12 细胞孵育24 h 后，在每孔中加入MTT 溶液（20 μL，质量浓度为5 g/L）孵育4 h。完成后除去上清液，接着加入150 µL DMS，低速振荡10 min，用酶标仪测试各体系在490 nm 处的吸光度。通过式（3）计算细胞存活率：

式中：CR 为细胞存活率，%；A 和A0 分别为MQH2O2实验组（细胞孵育探针组）和对照组（细胞未孵育探针组）的吸光度。

1.4.3 细胞外源性H2O2 的检测

使用不同浓度（0、10、50、100 µmol/L）的H2O2 分别孵育细胞30 min 后，PBS（pH=7.4）洗涤除去残留的H2O2，利用10 µmol/L 探针MQH2O2 孵育10 min。成像时双光子激发波长设置为730 nm，荧光收集范围为420～480 nm（蓝色通道）及530～600 nm（绿色通道）。

1.4.4 OGD/R 细胞模型的建立

在无糖及无血清的DMEM 细胞培养基中，将PC12 细胞置于三气培养箱中（37 ℃，赋予细胞无氧环境）孵育不同时间（0、3、6、12 h）后，使用含有葡萄糖和血清的DMEM 细胞培养液替换原培养液，并在37 ℃培养箱中常氧培养PC12 细胞12 h建立细胞OGD/R 模型。Sham 组（假手术组）指细胞未进行OGD/R 处理，只用MQH2O2（10 µmol/L）孵育20 min；对照组为细胞进行OGD/R 12 h 处理后孵育MQH2O2（10 µmol/L）20 min。NOX-2KD组为利用病毒法将胞内NOX-2（ROS 合成蛋白）基因敲击（NOX-2KD）后进行 OGD/R 处理并孵育MQH2O2（10 µmol/L）20 min；阴性对照组（Negative）与NOX-2KD 组对应，为阴性对照组，通过孵育未有DNA 结构的病毒，由于无法干扰细胞正常DNA序列导致无法实现NOX-2 蛋白的敲除。细胞成像前将PC12 细胞用PBS（pH=7.4）清洗2 次，成像时双光子激发波长设置为730 nm，荧光收集范围为420～480 nm（蓝色通道）及530～600 nm（绿色通道）。

1.4.5 MCAO 模型的建立

取8～10 周龄的C57BL/6 雄性小鼠饲养在(22±2) ℃、相对湿度50%±10%条件下，统一喂食标准饮食（AIN-93M），12 h 光/暗周期进行2 周的适应性喂养。所有的实验步骤遵循实验动物护理和使用指南：第八版，ISBN-10：0-309-15396-4，由武汉大学动物伦理委员会批准（No.WDRM-20170504）。MCAO 模型的建立根据文献[15]操作。

2 结果与讨论

2.1 探针MQH2O2 的合成方法、响应机理及密度泛函理论（DFT）分子轨道图

MQH2O2 与H2O2 的识别机理如图1a 所示。由图1a 可知，MQH2O2 中硼酸酯部分与H2O2 反应后硼酸酯脱落，释放荧光团MHQMB（离子状态）。为了 解 MQH2O2 对 H2O2 响 应 的 机 理， 在B3LYP/6-31G(d)水平，利用DFT 完成了MHQMB（包括中性状态和离子状态，在水环境中）和MQH2O2的计算（图1b）。结果显示，MQH2O2 与MHQMB（中性状态）分子能隙〔最高占据分子轨道（HOMO）向最低未占有分子轨道（LUMO）激发所需要的能量〕可忽略不计，且均比MHQMB（离子状态）分子能隙高，表明该分子发生分子内电荷转移（ICT），最终导致分子能极差发生变化，光物理性质随之改变。此外，苯并噻唑上的甲氧基增加了MQH2O2 电子云密度，提高了探针HOMO 和LUMO 的对称性，从而保证其较高的荧光量子产率。

2.2 探针荧光响应

2.2.1 双光子荧光活性截面

按照1.3 节实验方法，通过双光子诱导荧光法测 定 并 计 算 MQH2O2 （ 10 µmol/L ） 与 H2O2（200 µmol/L）在反应前后的双光子荧光活性截面，结果如图2 所示。

由图2 可知，在710～800 nm 范围内，MQH2O2与H2O2 反应前双光子荧光活性截面较小，在740 nm处仅有76 GM，而与H2O2 反应后在740 nm 处出现最大的双光子荧光活性截面，可达150 GM，增加了74 GM，表明该荧光染料双光子荧光活性截面较大，具有较好的双光子性能，可将其应用于双光子共聚焦成像中。

2.2.2 MQH2O2 与H2O2 荧光响应检测

MQH2O2与不同浓度H2O2响应后的荧光发射谱图见图3。

由图3 可知，随着H2O2 浓度的不断增加，反应体系在535 nm 处的荧光强度（I535）不断增强，465 nm处的荧光强度（I465）不断降低，形成比率型响应，加入H2O2（300 µmol/L）比未加H2O2 的检测液的荧光强度比值（I535/I465）在30 min 内增加了25.4 倍。H2O2 浓度（y，0～300 µmol/L）与I535/I465（x）的关系曲线为y=0.02534x+0.01356，相关系数（R2）为0.998。由 3σ/k 计算得出检出限（LOD）为38.6 nmol/L，其中：σ 为11 组MQH2O2 溶液在I535/I465的标准偏差；k 为MQH2O2 滴定光谱曲线在线性范围内的斜率。结果表明，探针MQH2O2 具有较高的灵敏度和准确性。

2.2.3 MQH2O2 与H2O2 响应时间检测

MQH2O2与H2O2响应时间的测定结果如图4 所示。

由图4 可见，MQH2O2 与H2O2 在30 min 内反应完全，表明探针具有较快的响应能力，适用于H2O2 的原位成像分析。

2.2.4 MQH2O2 对H2O2 的选择性和pH 稳定性

探讨了10 µmol/L MQH2O2 对14 种不同干扰物（浓度均为100 µmol/L 的Fe2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+；浓度均为300 µmol/L 的HClO、ONOO-、单线态氧（1O2）、•O2-；浓度均为500 µmol/L 的NO2-、NO；浓度均为1.0 mmol/L 的半胱氨酸（Cys）、谷胱甘肽（GSH）、高半胱氨酸（Hcy）；300 µmol/L H2O2）的响应，结果如图5a 所示。

由图5a 可见，除 H2O2 外，干扰物均未使MQH2O2 的I535/I465 发生明显变化，表明该探针对H2O2 可进行特异性识别。此外，探究了MQH2O2 与H2O2（300 µmol/L）在不同pH 下反应30 min 前后I535/I465 的变化，结果见图5b。由图5b 可以看出，随着pH 的不断增加，MQH2O2+H2O2 体系的I535/I465显著增加，这是由于在中性或弱碱性条件下MQH2O2 更多以离子状态存在，而通过上述分析可知，离子形式的MHQMB 具有更高的ICT 能力，从而在长波长处展现出更高的荧光强度。更为重要的是，本文研究对象均为中性环境，因此，保证了MQH2O2在检测H2O2 时具有合适的灵敏度。

2.3 细胞毒性

在生物成像之前，考察了探针MQH2O2 的细胞毒性，结果如图6 所示。

由图6 可见，探针MQH2O2 浓度达30 µmol/L时，仍有>83%的细胞可以存活，表明该探针毒性较小，可用于较长时间观察细胞内H2O2 的水平变化。

2.4 细胞外/内源性H2O2 的检测

2.4.1 细胞外源性H2O2 的检测

按1.4.3 节实验方案，探究探针MQH2O2 对细胞外源性H2O2 的成像分析，结果如图7 所示。

由图7 可知，随着H2O2 浓度的增加，绿色通道荧光逐渐增强，而蓝色通道荧光逐渐减弱，绿色通道与蓝色通道的I535/I465 呈梯度增加，表明该探针可实现高灵敏检测细胞外源性H2O2。

2.4.2 细胞内源性H2O2 的检测

为了探讨探针MQH2O2 检测细胞内源H2O2 的能力，利用PMA 刺激细胞产生H2O2，并用NAC 清除细胞内H2O2，评估探针对于内源性H2O2 的检测能力，结果如图8 所示。由图8 可知，未处理的细胞（对照组）使用探针MQH2O2 孵育后蓝色通道荧光较强，绿色通道几乎没有荧光；而使用质量浓度为2 mg/L PMA 预处理后，观察到细胞内绿色通道荧光显著增强，蓝色通道荧光却几乎消失，说明PC12 细胞在PMA 刺激下产生大量H2O2。因此，绿色通道与蓝色通道的I535/I465 有明显增加。

当细胞使用质量浓度为2 mg/L 的PMA 预处理细胞1 h 后，用质量浓度为2 mg/L 的NAC（H2O2清除剂）处理细胞，绿色通道荧光再次消失，绿色通道与蓝色通道的荧光强度比值明显降低，且低于对照组（PC12 细胞未孵育PMA 和NAC，直接与MQH2O2 孵育），说明NAC 可清除掉包括PMA 刺激下产生的所有内源性H2O2，充分证实探针MQH2O2可检测细胞中内源性H2O2 的水平变化。

2.5 OGD/R 模型中的细胞成像

使用OGD/R 来模拟脑卒中过程，考察脑卒中过程中H2O2 含量的变化。结果如图9 所示。

由图9 可知，相比于Sham 组，对照组I535/I465增加明显；阴性对照组的I535/I465 相比于NOX2KD组有明显升高，结果清晰显示基因沉默后H2O2 的含量急剧降低。进一步证实探针MQH2O2 可以检测OGD/R 过程中H2O2 的含量变化。

2.6 MCAO 模型的组织成像

利用Z-Stack 技术，观察探针MQH2O2 在脑组织中不同深度的成像，结果如图10 所示。

由图10 可知，该探针的成像深度可达225 μm，充分证明该探针可实现利用双光子激光显微镜对深部组织中的H2O2 进行成像分析。

随后按照1.4.5 节实验方案，通过MCAO 成功建立小鼠脑卒中模型，分为正常小鼠脑组织、卒中1 及3 d 3 种小鼠模型。将小鼠模型分为两组，对照组和APO（Apocynin，NADPH 氧化酶抑制剂）组，对照组为小鼠模型建好后直接尾静脉注射探针MQH2O2；APO 组在小鼠模型建好后，先注射APO（10 mg/L，200 μL），30 min 后再注射探针MQH2O2（10 µmol/L），并分别对其进行双光子激光共聚焦成像。脑组织切片成像如图11 所示。

由图11 可知，随着卒中时间的推移，对照组蓝光通道荧光逐渐减弱，而绿色通道荧光逐渐增强，比率（I535/I465）响应信号也随之增加，而注射APO后，绿色通道荧光明显减弱，而比率响应信号变化较小。该实验结果与细胞实验相一致，均是由于H2O2 浓度的降低而引起的变化，表明探针MQH2O2可实现小鼠脑卒中过程中的原位成像分析。

2.7 探针性能比较

从是否为比率型荧光探针、比率型荧光探针双发射峰对应的最大发射波长λem1/λem2、线性范围、相关系数和检出限5 方面将探针MQH2O2 与近年来合成的一些较经典H2O2 荧光探针进行对比，对比结果和探针结构如表1 和图12 所示。由表1 可见，本研究探针线性范围最大，相关系数最高，且检出限足够低，因此检测的准确度更高。

3 结论

以6-甲氧基苯并噻唑-2-羟基喹啉作为双光子荧光团、硼酸酯作为过氧化氢的识别基团，成功构建了比率型双光子H2O2 荧光探针MQH2O2。结果表明，MQH2O2 不仅具有30 min 内响应倍数为25.4 倍，检出限低至38.6 nmol/L，且具有高的选择性、生物相容性以及稳定性。更为重要的是，由于比率型荧光探针能够对环境影响进行内置校正，因此MQH2O2 在响应H2O2 过程中具有优异的线性范围（38.6 nmol/L～300 µmol/L）和相关系数（R2=0.998），保证了探针能够实现更准确的荧光分析。该探针成功完成了脑卒中诱导细胞氧化应激过程的精准原位成像分析，通过使用OGD/R 和MCAO 分别处理细胞和小鼠用来模拟脑卒中过程，利用APO药物抑制和NOX-2 基因沉默方式抑制氧化应激，证明脑卒中可以诱导细胞氧化应激过程。为此，通过脑卒中诱导细胞氧化应激过程这一原理，探针MQH2O2 在脑卒中的早期精准诊断领域具有广阔的应用前景。

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