生物法绿色合成纳米银及其抗菌应用进展
《精细化工》
2024年 41卷
第1期
20230053
中图分类号：TB383.1；O614.122
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摘要
纳米银是研究和应用最广泛的纳米材料之一。近年来，为避免纳米银合成过程中产生有毒副产物，研究者在纳米银的绿色合成方面进行了诸多研究。首先，综述了生物法绿色合成纳米银，重点介绍了微生物法、植物提取物法；接着，介绍了纳米银抗菌性的机理和影响因素；然后，总结了纳米银的抗菌应用；最后，指出植物各组织和微生物细胞中富含的各类天然化合物均可完成纳米银的绿色合成，不同生物源合成纳米银的潜力有待进一步发掘。纳米银尺寸和形状的可控化以及在使纳米银发挥抗菌作用的前提下减少迁移、减少副作用是下一步的研究重点，对未来发展提出了建议。
关键词: 纳米材料 银 绿色合成 抗菌性能 抗菌应用
纳米技术是20世纪90年代逐步发展起来的与多学科交叉的前沿科技领域。纳米材料具有独特的体积效应、表面效应和量子尺寸效应，这导致材料的力学、磁性、光学乃至热力学等性能有了惊人的改变。金（Au）、银（Ag）、铜（Cu）、铁（Fe）、锌（Zn）等金属纳米粒子表现出良好的抗菌活性，相较于其他金属，银纳米颗粒（AgNPs）拥有更好的经济效益和更优秀的抗菌性能，从而更合乎工业发展的需要 。
AgNPs的合成方法可以分为两大类：自上而下法和自下而上法 （如 表1 所示）。自上而下法是指通过激光烧蚀、研磨、光刻等破坏性手段将银金属处理到纳米级，被认为是物理法 。化学和生物法则被认为是自下而上的方法，是将银前体在原子、分子级别合成为AgNPs。化学方法包括化学还原、电化学、光化学、微乳液等多种手段，被认为是方便、高效和易于后处理的方法，应用最为广泛，但这种方法会有有毒的副产物产生 。虽然采用化学和物理方法可制备出稳定、纯净的纳米颗粒，但是成本高昂且对环境有潜在危险。生物法则是利用微生物（如细菌、真菌等）和植物提取物合成AgNPs的绿色合成方法。生物法中的绿色植物合成AgNPs，是一种生态友好、无毒且具有成本效益的方法，此方法合成得到的AgNPs稳定性好、粒径均匀且合成过程中携带的副产物无毒 。由此可见，绿色合成AgNPs合乎工业发展要求，具有广阔的应用前景，是当今的研究热点。
表1 AgNPs的合成方法
1 生物法绿色合成AgNPs
生物合成AgNPs是一种简单、直接的绿色合成方法，目前主要分为植物提取物法和微生物法。生物法绿色合成的AgNPs具有良好的生物相容性，这种生物相容性会随着使用的生物来源不同而发生变化 。此方法中所需的还原剂均为生物基化合物（例如：黄酮、多糖、蛋白质、多酚和有机酸等），这些物质在反应过程中覆盖于AgNPs表面，起着封端剂的作用 。近年来，人们广泛研究了植物和微生物介导合成不同形状、尺寸和抗菌效果的AgNPs。
1.1 微生物法
微生物法合成AgNPs，是利用细菌、真菌等微生物介导的合成AgNPs的一种绿色方法（如 图1 所示）。微生物法合成AgNPs是在研究AgNPs抗菌性能的过程中发现的一种合成AgNPs的方法。AgNPs对大多数微生物细胞具有高细胞毒性，但少数几种微生物细胞表现出银抗性，可以在富银环境中存活甚至可以在细胞壁处积累银，因此利用微生物收集矿石工业中的银的想法被提出 。微生物法具有反应产物不易团聚、反应条件温和、有毒副产物较少等优点 。但同时此方法也存在一些缺陷，从选取合适菌株的高昂经济成本到培养菌株所需的苛刻条件，再到合成AgNPs漫长的时间成本，同时整个过程中pH、温度、浓度等变量因素带来的影响都限制此方法的发展和应用 。
图1 微生物介导的AgNPs绿色合成过程示意图
细菌对重金属离子有良好的还原能力，拥有细胞内和细胞外两种合成AgNPs的途径 ，如 图2 所示。细菌可以在细胞壁上积累Ag + ，将其吸收进细胞内由胞内生物质还原为Ag原子 ，也可以通过细胞生物质或者培养液上清液中的胞外酶合成AgNPs 。THOMAS等 以一种新型海洋假单胞菌进行了细胞内和细胞外两种方式的AgNPs合成，成功合成出粒径尺寸范围在156~265 nm之间的球形AgNPs。细菌细胞内合成AgNPs是一个复杂的过程，需要超声处理或使用化学试剂破坏细胞壁来释放聚集的AgNPs，后续还需要多种后处理来去除杂质 。细菌细胞外合成AgNPs相对简单，通过利用细胞生物质或培养物的上清液来实现胞外的合成过程，后续处理简单，更具经济效益，更适合大规模AgNPs的生产 。
图2 微生物介导的AgNPs合成机制
真菌同样是AgNPs生物合成的优良还原剂和稳定剂 。真菌能分泌大量的酶和其他代谢产物，无论是在真菌细胞内，还是在细胞生物质和培养液上清液中均表现出对Ag + 的还原性 [17-18] 。
与细菌相比，真菌具有更高的结合和生物累积能力、更容易的细胞内摄取和后处理等优势 。真菌合成AgNPs主要涉及两个步骤，一是在真菌菌丝体的最外层表面上包埋Ag + ；二是真菌因为Ag + 的附着而进入一种自我防护状态，分泌胞外酶和代谢物，从而导致Ag + 还原为Ag 0 ，聚集形成AgNPs 。因此，真菌合成AgNPs的过程更易在细胞外进行。且真菌的细胞内合成同样需要物理或者化学方法破坏细胞来释放合成的AgNPs，所以真菌细胞外合成AgNPs是更广泛的使用方法 。
1.2 植物提取物法
利用植物提取物介导合成AgNPs，是通过将植物洗净切碎，将其干燥或直接使用新鲜植物放入去离子水或醇中加热来制备提取物，之后将Ag + 前体（通常为硝酸银）与提取物混合来合成AgNPs （如 图3 所示）。合成效果受pH、温度、反应时间、植物提取物和Ag + 浓度等多个因素影响 。植物提取物可来源于植物的花、茎、叶、根、果实等各个部分 。这些植物组织中富含多种初级和次级代谢化合物（如多糖、蛋白质、黄酮、类黄酮、生物碱、多酚等），在AgNPs的合成过程中充当还原剂和封端剂 （如 图4 所示）。此方法所需条件简单、对环境无任何危害、经济效益高且原料来源广泛，工业生产可行性很高。MAHENDRAN等 认为，利用植物介导合成AgNPs是一种适于大规模生产的，绿色且稳定的工艺，已成功通过芳香蕨叶提取物合成了粒径尺寸在44 nm左右的AgNPs。RODRÍGUEZFÉLIX等 利用红花水提取物为原料绿色合成了AgNPs，认为农业食品废弃物同样适用于AgNPs的绿色合成，既可减少环境污染，又可满足AgNPs的合成需求，是一种环境友好的可持续方法。利用植物提取物介导合成AgNPs具有良好的发展前景。近期部分植物提取物介导AgNPs合成的结果列于 表2
图3 植物提取物介导的AgNPs绿色合成过程示意图
图4 植物提取物介导的AgNPs绿色合成机制示意图
表2 植物提取物介导AgNPs的合成
2 AgNPs抗菌性的机理和影响因素
2.1 AgNPs抗菌机理
AgNPs抗菌性能的研究一直是热门方向，其抗菌机理同样是争论的热点，是通过本身还是释放Ag + 发挥作用，通过哪种途径发挥作用，哪一种起主要作用等均没有定论。AgNPs抗菌机理主流的说法有以下几种（如 图5 所示）：（a）破坏细胞膜。释放Ag + 吸附于微生物细胞膜，凭借其较大的比表面积，逐步渗透并破坏细胞膜，使细胞质外流导致微生物死亡 。（b）催化产生活性自由基。凭借AgNPs较强的催化活性，促进微生物细胞内活性自由基的产生，破坏细胞质，抑制细菌生长，从而达到抑菌效果 。（c）抑制蛋白质作用。与细胞内蛋白质中的磷和硫结合，影响其活性，导致细胞的正常功能受损，实现抗菌效果 。（d）影响DNA合成。破坏DNA保护蛋白，与DNA发生交联，抑制DNA合成与复制，使DNA断裂成小分子，从根本上阻断微生物的繁殖，达到抗菌目的 。
图5 AgNPs的抗菌机制示意图
2.2 影响因素
AgNPs的抗菌效果受粒径、形状、浓度等多个因素影响。AgNPs对微生物细胞破坏作用和细胞毒性主要依赖纳米颗粒的数量和比表面积，粒径越小，比表面积越大，更易附着于微生物细胞的表面，从而渗透进细胞内部，进而表现出更好的抗菌作用 。YUNUSOV等 研究不同粒径尺寸的AgNPs对棉织物抗菌性的增强效果，研究发现，与长130~420 nm、宽15~40 nm的AgNPs晶须相比，5~35 nm的球形AgNPs即使在浓度低一个数量级的条件下，仍表现出更强的抑菌活性，证明AgNPs的尺寸越小，抗菌效果越好。除粒径外，AgNPs抗菌效果还与纳米颗粒形状有关，DEBASHISH等 对不同形状AgNPs抗菌效果的研究结果表明，球形、棒状、三角形和六边形的AgNPs均具有良好的抗菌活性，在相同浓度下，球形AgNPs有更高的杀菌率，尤其在质量浓度为200 mg/L时，球形AgNPs杀菌率在70%以上，而其他几种形状AgNPs的杀菌率均在30%以下。AgNPs携带的表面电荷同样是影响其抗菌活性的重要因素，由于细胞表面携带负电荷，所以表面电荷为正的AgNPs比表面电荷为负的AgNPs更易附着于细胞表面，而表面电荷为正的AgNPs比表面电荷为负的AgNPs在细胞内存在的时间更长，所以表面电荷为正的AgNPs表现出的抗菌活性更好 。AgNPs的抗菌效果在实际作用时受以上多因素协同影响，综合考量下，粒径小、形状规则偏球形且表面电荷为正的AgNPs的抗菌活性更好。
在AgNPs合成过程中，对粒径和形状有影响作用的主要是时间、温度等实验条件和分散剂、封端剂的添加。实验条件方面，温度的影响尤为明显，在不影响反应各组分活性的范围内，高温要比低温更易形成小粒径、球形的AgNPs 。分散剂的使用是为了得到均匀、稳定、高纯度的AgNPs，具体效果与种类、用量均有联系。AgNPs合成过程中常用的分散剂有水性聚合物、肽类以及一些小分子类分散剂等。其中，小分子类分散剂效果更为明显，可使AgNPs粒径更小 [23,47] 。封端剂可以抑制AgNPs的生长，从而得到更小粒径的AgNPs，但剂量需与银前体的量达到平衡，过低效果不理想，过高会有反效果，使AgNPs粒径变大 。常用的封端剂有多酚、聚合物、表面活性剂、羧酸衍生物等，柠檬酸盐是最为常用的封端剂之一，其作为封端剂的同时还起到调节pH和保护配体的作用，保证了AgNPs的稳定和生长 。分散剂和封端剂的种类则是影响AgNPs形状的主要因素，使用的分散剂和封端剂不同，得到AgNPs的形状也不同 。ZENG等 以分子动力学模拟方法计算了酯磺酸盐、十二烷基硫醇和十六烷基三甲基铵等多种表面活性剂与银晶面的相互作用能，并与实际AgNPs的制备进行比较，确定金属纳米颗粒的形状可以通过使用不同的表面活性剂来控制。植物提取物中各类天然化合物充当分散剂和封端剂的作用，由不同植物源提取物合成的AgNPs的粒径和形状也不相同（ 表2 ）。
2.3 AgNPs的迁移
AgNPs在诸多应用中均存在迁移现象，细胞毒性是限制其发展的最主要因素。环境方面，AgNPs在各类应用中的最终流向都是水环境和土壤，其对原有生态环境中各级生物均有严重影响，由底层的微生物层层向上，AgNPs的富集和对细胞的影响层层加深，影响整个生态系统，是一种很严重的环境破坏 。人类作为生物链的顶端，AgNPs同样会在人类细胞中富集，AgNPs进入人体后，可分布于人体各器官，其对微生物细胞的抑制作用同样适用于人体细胞，会导致毒性作用和慢性疾病，如过敏、哮喘、各种炎症、心血管疾病和癌症等 。降低AgNPs迁移最有效的方法是对其进行包覆，包覆技术可以通过银颗粒之间的静电稳定作用来提高银纳米颗粒的稳定性，减少银纳米颗粒的团聚，从而避免AgNPs对活细胞的影响 。PARK等 探索裸露的AgNPs和不同有机物包覆的AgNPs对红摇蚊的生理毒性，以裸露的AgNPs处理的幼虫死亡率在最高质量浓度5 mg/L下<10%，而由有机物包覆的AgNPs的致死率在不同质量浓度下均<5%，有机物包覆的AgNPs水中逸散出的离子的量和聚集程度比裸露的AgNPs均有所降低，结果证明，包覆可有效降低AgNPs的迁移和生物毒性。
3 AgNPs的抗菌应用
AgNPs抗菌性能十分优秀，作为抗菌剂在食品包装、生物医学、农业、水污染治理等多个行业具有广泛的应用（如 图6 所示）。但AgNPs在诸多具体应用中存在迁移现象，其细胞毒性是限制应用方向的主要因素。
图6 AgNPs的应用
3.1 食品包装
防止食物腐败变质、阻止微生物滋长引起的疾病传播、全面延长食品保质期是食品包装行业重要的目标，所以研究开发抗菌性能优异且安全可靠的活性食品包装是十分迫切的。食品包装行业中常见的方法是在包装中通过添加相关有机物（有机酸、酶和聚合物等）或者无机材料（金属纳米颗粒或者金属氧化物）来实现 。金属或金属氧化物的纳米颗粒能承受更加严苛的加工条件且不会对食品本身感官属性产生影响，在实际应用中更为流行 。食品包装中纳米材料的应用大致分为两类：（1）基于纳米复合材料的抗微生物包装，可以保护食品免受食品腐败微生物的侵害，并提高食品的货架期；（2）将纳米材料加入聚合物基体中改进包装，以提高其机械和阻隔性能 。AgNPs对食源性微生物有明显抑制和灭杀作用，在食品包装中加入AgNPs可有效保证食品质量 。AgNPs具有细胞毒性，在实际应用过程中AgNPs存在向食品迁移的现象，据欧洲食品安全局（EFSA）规定包装中银迁移的允许限值，水中为0.05 mg/L，食品中为0.05 mg/kg。因此，如何使AgNPs在发挥抗菌作用的同时，降低迁移量，保持在安全范围，是之后相关研究的重点。近期AgNPs应用在食品包装领域的研究成果如 表3 所示。
表3 AgNPs在食品包装中的应用
3.2 生物医学
AgNPs在生物医学领域的应用主要有药物输送、伤口敷料、癌症治疗、牙科技术和组织支架等 。AgNPs本身粒径较小且具有良好的生物相容性，可穿透组织细胞并稳定滞留，提高药物吸收能力，在目标位置发挥作用，是一种良好的药物输送载体 。而AgNPs应用于伤口敷料能有效抑制伤口处的细菌滋生，灭杀有害微生物 。AgNPs的比表面积较大，含AgNPs敷料能促进伤口更快愈合 。研究表明，AgNPs以剂量依赖性方式显示出对癌细胞具有高选择性的有效抗癌活性 。
而植物介导合成的AgNPs可通过细胞周期停滞降低癌细胞的增殖率来显示其抗癌活性 。在牙科技术中使用AgNPs主要是将其掺杂进牙科修复材料、牙科植入物和龋齿抑制溶液等口腔材料中，减少口腔材料上的微生物定殖，防止牙科手术期间和术后的感染 [70-72] 。AgNPs覆于组织支架中可有效灭杀细菌，防止感染，应用于支气管、骨组织、血管等多种人体组织支架 [73-74] 。AgNPs是在各种疾病的管理中研究和使用最多的纳米颗粒，在生物医学领域拥有广阔的应用前景 。近期AgNPs应用在生物医学领域的研究成果如 表4 所示。
表4 AgNPs在生物医学中的应用
3.3 农业
纳米技术应用于农业可以提高植物耐压力，使控释和靶向的农用化学品递送DNA或RNA，促进植物转基因，引发种子发芽和早期检测 。具体应用有纳米肥料、纳米除草剂、纳米农药、智能纳米输送系统等 。在土壤环境中，纳米材料能有效地吸附在矿物表面，其在土壤中迁移的延迟可避免养分流失 。纳米结构可以保证活性物质更稳定地长期存在，对害虫、病菌等有更长时间的灭杀和抑制作用，因此纳米肥料、除草剂、农药等比常规种类更稳定、高效 。掺有AgNPs的肥料可集肥效、杀菌和生长调节于一体，高效利用肥料，降低环境危害 。传感器上的电极沉积AgNPs可以更灵敏地检测除草剂是否发挥作用，及时对其进行脱氯，有效减少除草剂对人体健康和生态环境的不利影响 。但AgNPs细胞毒性仍是不可忽视的弊端，在各类应用中AgNPs最终大多都会流向土壤，其在灭杀有害微生物的同时也会危及有益菌群 。纳米技术应用于农业仍在起步阶段，多种理论还未得到验证，需要更多的实践研究来支撑。近期AgNPs应用在农业领域的研究成果如 表5 所示。
表5 AgNPs在农业中的应用
3.4 水污染治理
纯净可靠的水资源是人类生存与发展的重要前提，近年来由水污染引起的环境和健康问题不断增加，治理水污染问题迫在眉睫。与传统水处理方法相比，纳米技术是一种综合效益很高的方法，正被越来越多地应用于水污染治理中。AgNPs被认为是应用于水污染处理的最佳纳米材料之一 。AgNPs无论作为单独的纳米颗粒（NPs）使用或负载于其他材料（纳米复合材料）使用，在水污染处理中均有良好的表现 [92-93] 。水污染引起的疾病主要由水中的病原细菌等微生物引起，优异的抗菌性能且在水环境中良好的分散性使AgNPs能很好地起到灭杀病原菌的作用 。工业、农业以及生活废水中含有多种有机化合物，不经处理对环境和人体健康都有极大危害，AgNPs可通过吸附、催化降解、与其他材料复合使用等方法处理水中污染物 。由植物提取物介导绿色合成的AgNPs是环境友好的，近年来与其相关的水污染处理研究不断增加。但AgNPs在治理水污染的同时，可能会对环境中原有的生物有一定危害，如何使AgNPs更好地吸附在应用材料中，更合理地使用AgNPs是之后相关研究的重点。近期AgNPs应用在水污染治理领域的研究成果如 表6 所示。
表6 AgNPs在水污染治理中的应用
3.5 其他应用
AgNPs还可应用于纺织工业，用于制备内部织物具有纳米颗粒的银纳米复合纤维 。郭锐等 以茜草根提取物绿色合成的AgNPs对羊毛织物进行功能整理，得到的羊毛织物具有良好的抗菌性能，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。秦圆等 使用金银花提取物为还原剂制备了纳米氧化锌和AgNPs，以浸轧法将纳米粒子负载到棉织物上，二者配合使用赋予了棉织物良好的抗紫外和抗菌性能，紫外防护系数值达到了41.06，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率均达到95%以上。
在涂料中添加AgNPs可有效抑制细菌、真菌等微生物的病原性危害，减少交叉感染，从而最大程度减少施加此类涂料表面上的染色和材料降解 。LI等 采用空气喷涂法在聚合物薄膜上制备了茂金属聚乙烯/纳米银复合涂层，此复合涂层对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌率均在99.9%以上，在医疗器械和软包装薄膜等领域具有潜在的应用前景。
4 结束语与展望
生物法绿色合成AgNPs是一种成本效益高、生态友好、适于大规模生产的方法，是化学和物理合成方法的一大进步。综合比较几种生物源合成AgNPs的方法，植物提取物介导合成的AgNPs综合效益最高，适于工业化生产。优秀的抗菌性能使AgNPs在食品包装、生物医学、农业、水污染治理等行业中均有良好的应用前景。中国此领域的相关研究多关注于农业废弃物的利用，但具体关于AgNPs抗菌效果的尺寸与形状控制的相关研究与国际学者相比是不足的。在使用需求不断细化、应用条件愈加严苛的当下，AgNPs的形貌可控化以及如何在保证发挥抗菌作用的前提下减少迁移量是相关研究的下一步重点。生物法绿色合成AgNPs中影响AgNPs形貌的最主要因素是生物的种类，其中植物提取物介导合成的AgNPs形貌还与使用的植物部位有关。生物法绿色合成AgNPs应聚焦于更多的生物种类，以及相同种类不同部位的AgNPs合成效果，并对其差异化原因进行更深层次的研究。
