高酶活性β-甘露聚糖酶定向进化及其用于制备甘露寡糖

陈 赟，高伟强，梁 琪，周晓雷，王丽丽，张春晓*

（河北科技大学 食品与生物学院，河北 石家庄 050018）

摘要：为了提高β-甘露聚糖酶的活性，采用易错PCR 将来源于地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）KD-1 的β-甘露聚糖酶基因manBl 进行定向进化，并在枯草芽孢杆菌（B. subtilis）中进行表达，以筛选酶活性提高的β-甘露聚糖酶突变体。筛选得到的突变体ManBl(I91N/L211I)，其比酶活性为15554.7 U/mg，是野生型ManBl 的4.1倍，食品级表达的胞外酶产量达17601.3 U/mL。分子动力学和分子对接结果表明，β-甘露聚糖酶在2 个位点（I91N/L211I）的突变，导致蛋白催化口袋柔性增加，与底物结合能力提高，进而提高了酶的催化效率。β-甘露聚糖酶ManBl(I91N/L211I)水解魔芋胶产物主要由甘露六糖、甘露三糖和甘露二糖组成。报道的I91N/L211I 2 个位点联合突变能够提高β-甘露聚糖酶活性；ManBl(I91N/L211I)食品级表达为该酶的绿色安全应用奠定了基础。

关键词：β-甘露聚糖酶；枯草芽孢杆菌；定向进化；食品级表达；甘露寡糖；制备；生物工程

中图分类号：O636.1；TQ426.97；Q789

文献标识码：A

文章编号：1003-5214 (2023) 11-2454-09

收稿日期：2022-12-29; 定用日期：2023-04-07;

DOI: 10.13550/j.jxhg.20221182

基金项目：河北省重点研发计划项目（21372802D、19222906D）

作者简介：陈 赟（1995—），男，硕士生，E-mail：2428991358@qq.com。联系人：张春晓（1971—），女，副教授，E-mail：cxzhang2009@163.com。

Directed evolution of β-mannanase with higher enzymatic activity and its application for mannooligosaccharide production

CHEN Yun, GAO Weiqiang, LIANG Qi, ZHOU Xiaolei, WANG Lili, ZHANG Chunxiao*
（College of Food Science and Biology, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, Hebei, China）

Abstract: To improve β-mannanase activity, β-mannanase gene from Bacillus licheniformis KD-1 was amplified by error-prone PCR for directed evolution and further expressed in B. subtilis to screen mutants with higher β-mannanase activity.It was found that the specific activity of mutant β-mannanase ManBl(I91N/L211I) was 15554.7 U/mg, which was 4.1 times of wild-type ManBl, while the extracellular yield of ManBl(I91N/L211I) expressed in B. subtilis at food-grade level reached 17601.3 U/mL.The data from molecular dynamics and molecular docking showed that the mutation at two sites (I91N and L211I)led to the enhancement of the catalytic pocket flexibility and the affinity with the substrate, thus improving the catalytic efficiency of the enzyme.Furthermore, the β-mannanase ManBl(I91N/L211I) could hydrolyze konjac glucomannan (KGM) into mannooligosaccharides (MOS) with different degree of polymerization(DP) and main composition of mannohexaose, mannotriose, and mannobiose.The combined mutation of I91N/L211I could increase β-mannanase activity.And the food-grade expression of ManBl(I91N/L211I)laid the foundation for the green and safe application of the enzyme.

Key words: β-mannanase; Bacillus subtilis; directed evolution; food-grade expression; mannooligosaccharides;preparation; bioengineering

β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）是一种能够随机水解甘露聚糖的β-1,4-糖苷键的水解酶[1-2]。该酶可应用于多个领域，如作为饲料添加剂应用于动物养殖中，通过降解抗营养物质提高饲料的利用率[3]；应用于造纸和制浆工业，可提高漂白纸浆的亮度，降低纸浆漂白过程中的卡帕数和化学物质的含量，并可回收利用椰子和咖啡废料[2,4]；此外，应用于洗涤业，可有效去除污渍[5]；应用于食品工业，可降低咖啡提取物的黏度等[6]。

β-甘露聚糖的水解产物为甘露寡糖（MOS），含2～12 个甘露单糖[7]。MOS 作为非降解性寡糖，能够促进乳杆菌（Lactobacilli）和双歧杆菌（Bifidobacteria）等有益菌的生长，并能抑制致病微生物的繁殖[2]；MOS 也是一种对人类健康有益的功能性食品[8]。基于MOS 的重要性及市场需求，建立一种简便且经济有效的MOS 制备方法尤显重要。魔芋胶（KGM）是一种可食用纤维，用作食品和饮料中低值的凝胶剂和增稠剂[9]。因此，将低值KGM 转化成高值MOS具有重要意义。尽管已报道了多种不同特性的β-甘露聚糖酶[2,10-11]，如来源于Bacillus sp.MK-2 的β-甘露聚糖酶突变体MEIR 和Bacillus sp.CFR1601的 β-甘露聚糖酶，酶比活性分别为 9003.1 和10461.5 U/mg[12-13]，是目前报道酶活性较高的β-甘露聚糖酶，但仍难以满足精细化工行业的需求。因此，需要筛选更高酶活性和稳定性较佳的酶。为了提高酶产量，对β-甘露聚糖酶基因进行了异源表达，包括大肠杆菌（E. coli）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、植物乳杆菌（L. plantarum）、酿酒酵母（S. cerevisiae）和毕赤酵母（P. pastoris）等[2,14-15]。然而，这些表达系统通常是建立在抗生素筛选表达系统上，限制了其在食品和养殖业中的应用。因此，只有筛选高酶活性的β-甘露聚糖酶，并建立其食品级表达系统，才能满足在食品及养殖业中无抗生素残留的要求。食品级表达系统是指所选菌株应为食品安全的微生物，并且不应使用抗生素筛选标记[16-17]。B. subtilis 是革兰氏阳性细菌，一般被认为是安全生物（GRAS）[18]，其具有强大的分泌能力及培养鲁棒等优点，常被用作细胞工厂或合成生物学的底盘细胞生产酶和化学产品[19]。但应用B. subtilis 食品级表达的酶仅见阿洛酮糖异构酶和含铁酸性脲酶[18,20]，有关β-甘露聚糖酶的食品级表达鲜见报道。

本文拟从地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）中克隆该β-甘露聚糖酶基因manBl，并通过易错PCR 对该酶进行定向进化，筛选高酶活性的突变体；其次，应用CRISPR/Cpf1 技术无痕敲除B. subtilis D-丙氨酸变位酶基因dal，将B. subtilis 载体的抗生素基因替换为dal 基因，构建基于dal 基因互补的B. subtilis食品级表达系统；最后，应用该酶进行MOS 的制备。本研究旨在筛选高酶活性的β-甘露聚糖酶，建立其食品级表达系统，并应用该酶将低值KGM 转化为高值MOS。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

Fastpfu、EasyTaq、dNTP、DNA Marker、蛋白Marker、dTTP、dCTP、dATP、dGTP、MgCl2，AR，北京全式金生物技术有限公司；无缝克隆试剂盒和退火缓冲液，AR，上海生工生物工程有限公司；寡核苷酸引物，AR，英潍捷基（上海）贸易有限公司合成；KGM，BR，湖北惠葡有限公司；3,5-二硝基水杨酸（DNS，BR）、D-甘露糖（BR）、刚果红染料（BR）、琼脂粉（BR）、Lowry kit 试剂盒（AR）、三(羟甲基)氨基甲烷（Tris，AR），北京索莱宝科技有限公司；琼脂糖，AR，Biowest Agarose 公司；酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨，AR，OXOID 公司；甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖、甘露六糖，AR，上海惠诚生物科技有限公司；NaCl、KH2PO4、MgSO4•7H2O、KCl、MnCl2，BR，国药集团化学试剂有限公司。

Biometra Tone 梯度PCR 仪，德国耶拿公司；Quantity One 凝胶成像系统，美国BioRad 公司；BIFUGE STRATOS 全能台式高速冷冻离心机，美国Thermo Scientific 公司；ÄKTA 色谱系统，美国GE公司；SpectraMaxm i3x 多功能酶标仪，美国Molecular Devices 公司；1260 液相色谱仪，美国Agilent 公司；CHB-202 恒温金属浴，杭州博日科技有限公司。

1.2 菌株、质粒、引物及培养基

从河北科技大学校园土壤中分离得到 B.licheniformis KD-1 菌株，目前保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC 编号18964）；B. subtilis DB104 和质粒pWB980 为WONG 教授赠送[21-22]，其他质粒和菌株见表1 和表2，所用引物见表3。

种子培养基（均为质量浓度）：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.0。

发酵培养基（均为质量浓度）：KGM 5 g/L、蛋白胨5 g/L、KH2PO4 1 g/L、MgSO4•7H2O 0.1 g/L，pH 7.0。

1.3 方法

1.3.1 β-甘露聚糖酶基因随机突变及筛选

以P1 和P2 为引物，以B. licheniformis KD-1为模板，对manBl 基因进行易错PCR，PCR 缓冲溶液中包含 1 mmol/L dTTP/dCTP、0.2 mmol/L dATP/dGTP、6.8 mmol/L MgCl2、0.3 mmol/L KCl、0.5 mmol/L MnCl2、0.2 µmol/L P1、0.2 µmol/L P2 和1.0×104 U/L EasyTaq。PCR 程序为 95 ℃预变性5 min；94 ℃/30 s；55 ℃/30 s；72 ℃/2 min，35次循环；72 ℃/10 min。以P3 和P4 为引物，对质粒pWB-manBl 通过PCR 进行线性化。参照文献[25]方法，采用POE-PCR 方法将上述两种PCR 产物进行融合，形成DNA 片段多聚体，POE-PCR 条件为94 ℃/30 s；55 ℃/30 s；72 ℃/7 min，35 次循环。

参照文献[26]方法，将获得的POE-PCR 产物转化至B. subtilis DB104 感受态细胞。转化子（所含有的质粒标记为pWB-MBMn，n 为1、2、3……）在含有质量分数0.1%刚果红和质量浓度为10 mg/L卡那霉素的LB 平板上进行初筛。具有较大透明圈的克隆接种至24 孔板，在37 ℃、180 r/min 培养12 h，并测量各菌株的酶活性进行第二次筛选，将酶活性提高5%的菌株进行测序，并进行摇瓶发酵。

1.3.2 dal 基因敲除质粒的构建

根据CRISPOR〔CRISPOR（tefor.net）〕在线软件设计dal crRNA 序列[27]。一对27 nt dal-crRNA-F和dal-crRNA-R 寡核苷酸（10 μmol/L)，经退火，形成23 bp 的双链及5'端有4 nt 的突出末端分子[23]，接着将该退火产物稀释10 倍，与经Eco31Ⅰ酶切的pcrF11 进行连接，构建pdal1 质粒。以B. subtilis DB104 基因组DNA 为模板，分别以P5 和P6 为引物，P7 和P8 为引物，分别扩增dal 基因上、下游1 kb 同源臂，应用P9 和P10 为引物，将dal 基因上、下游同源臂进行融合PCR，并与PstⅠ和Hind Ⅲ酶切的pdal1 质粒进行连接，构建质粒pdal2。

1.3.3 枯草芽孢杆菌食品级表达系统的构建

应用CRISPR/Cpf1 技术敲除B. subtilis DB104 dal 基因[23,28]。将pHT-XCR6 和pdal2 质粒转入B.subtilis DB104 感受态细胞，加入质量浓度为30 g/L的木糖诱导8 h 以便敲除dal 基因[23]，构建B. subtilis DBFG-1 食品级表达系统。以P5 和P11 为引物，转化子基因组为模板，进行PCR，鉴定dal 基因是否敲除。质粒丢失按文献[23]方法进行。

采用POE-PCR 方法构建manBl(I91N/L211I)基因的食品级表达质粒pWB-DMBM3。首先，以P12和P13 为引物，B. subtilis 基因组DNA 为模板，克隆dal 基因；以P14 和P15 为引物，pWB-MBM3 为模板，扩增载体骨架；两种PCR 产物进行POE-PCR，并将PCR 产物转化入B. subtilis DBFG-1 感受态细胞，获得manBl(I91N/L211I)基因的食品级表达系统B. subtilis FGYM102。以P16 和P17 为引物，鉴定质粒构建是否正确。

1.3.4 蛋白纯化和定量

应用色谱系统纯化ManBl 及其突变体ManBl(I91N/L211I)，所有操作都在4 ℃进行。将菌株B.subtilis MTV13 和FGYM102 的第4 d 发酵液进行8000 r/min 离心15 min，再经0.45 μm 滤膜过滤2次，将100 mL 过滤后的发酵液装载至Q Sepharose XL XK 16/20 柱（柱床容积约30 mL），并以缓冲液A（20 mmol/L Tris, pH 7.0）平衡，未结合的蛋白用相同的缓冲液漂洗，结合的蛋白用0～1 mol/L NaCl（溶于缓冲液A）以3 mL/min 的流速进行洗脱，洗脱后样品蛋白浓度应用Lowry kit 试剂盒进行测定。

1.3.5 酶的生物化学性质测定

应用DNS 法测定β-甘露聚糖酶活性[29]，底物为溶于pH 6.0 的磷酸缓冲液的KGM（质量分数为0.5%）。将30 µL 适当稀释的酶或发酵液加入270 µL底物中，混匀后在60 ℃孵育10 min，再加入600 µL DNS，煮沸10 min，立即冰水冷却，测量540 nm 吸光度（OD540）。β-甘露聚糖酶活性的定义，1 U 为单位时间内给定实验条件下释放1 μmol D-甘露糖的量[1]。

在pH 6.0 下，测定不同温度（30～90 ℃）下酶活性，以确定酶的最适反应温度。将酶在70 ℃孵育30 min 后，并在标准条件下测定剩余酶活性，以确定酶的热稳定性。在最适温度下，测定不同pH（3.0～12.0）条件下的酶活性，以确定酶的最适pH。为了研究不同金属离子对酶活性的影响，10 mmol/L 不同金属离子溶液（K+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Na+、Cu2+、Mg2+）与等体积适当稀释的酶液混合，37 ℃孵育1 h，剩余酶活性在pH 6.0、60 ℃条件下进行测定，相同条件下未加金属离子处理的作为对照。有关酶活性测定实验重复3 次。

1.3.6 MOS 的测定

β-甘露聚糖酶水解KGM 的产物通过高效液相色谱法（HPLC）进行测定。在质量分数0.5%的KGM底物中加入0.5～50 U/mL 的β-甘露聚糖酶ManBl 或突变体ManBl(I91N/L211I)，在60 ℃反应30 min；或加入0.5 U/mL ManBl 或突变体ManBl(I91N/L211I)，在60 ℃ 孵育1～6 h，按1.3.5 节方法终止反应，水解产物12000 r/min 离心10 min，再经0.22 µm 滤膜过滤进行HPLC 分析，色谱条件为Welch XtimateTM Sugar-Ca 柱（7.8 mm×300 mm×8 µm），流动相为超纯水，流速为0.3 mL/min。甘露糖（DP1）、甘露二糖（DP2）、甘露三糖（DP3）、甘露四糖（DP4）、甘露五糖（DP5）和甘露六糖（DP6）用作标准品。

1.3.7 β-甘露聚糖酶结构及分子动力学模拟分析

β-甘露聚糖酶蛋白的基本性质，如相对分子质量和等电点（pI），通过在线软件Protparam（https://web.expasy.org/protparam/）进行分析，该酶的信号肽由SignalP-6.0 分析[30]，蛋白保守结构域由Interpro进行分析[31]。以RCSB 数据库中具有晶体结构的BCman 蛋白（2qha）为模板[32]，应用Modeller 软件进行同源建模预测β-甘露聚糖酶三维结构[33]，分子动力学模拟采用 GROMACS 软件进行[34]，使用GROMACS54a7 力场参数，将蛋白分子置于正方体盒子内，填充TIP3P 显性水模型，设置周期性边界条件、添加拮抗离子以中和负电荷。以含8 个糖单元的甘露聚糖分子为底物进行Autodock 分子对接分析[35]。

2 结果与讨论

2.1 manBl 基因定向进化及筛选

尽管β-甘露聚糖酶可来源于动物、植物和微生物，然而，野生型的酶因酶活性低、稳定性差等问题阻碍了其在工业领域中的应用[2,36]。由于 B.licheniformis KD-1 β-甘露聚糖酶（ManBl）具有较高的热稳定性[24]，为了进一步提高其酶活性，对ManBl成熟肽基因进行了随机突变。经SignalP-6.0 预测[30]，信号肽由N 端的24 个氨基酸组成。因此，成熟肽编码框为1008 bp。

应用易错PCR 对编码成熟肽的manBl 基因进行了突变，将manBl 基因及其突变产物克隆至枯草芽孢杆菌表达载体pWB980 的P43 启动子和sacB 信号肽基因下游，转化入B. subtilis DB104，通过刚果红平板筛选，获得了大约1000 个克隆，其中170 个克隆较对照有更大的透明圈。挑取具有较大透明圈的克隆至24 孔板培养进行第二次筛选，初测酶活性后，再将具有较高酶活性的菌株进行40 h 发酵培养，获得了酶活性提高5%、8%、24%的3 株克隆，分别命名为YM40、YM70、YM102。测序结果表明，3 个β-甘露聚糖酶突变体分别为ManBl(Y247D/T272M)、ManBl(S96G)和ManBl(I91N/L211I)。

2.2 manBl(I91N/L211I)基因食品级表达及蛋白纯化

鉴于β-甘露聚糖酶在食品及动物养殖中的广泛应用，将manBl(I91N/L211I)基因在B. subtilis 中进行了食品级表达，该系统的构建是基于D-丙氨酸消旋酶基因 dal 的互补性实现的[37]。首先，应用CRISPR/Cpf1 技术敲除B. subtilis 的D-丙氨酸消旋酶的食品级表达载体pWB-DMBM3；将基因dal 构建B. subtilis 食品级底盘细胞B. subtilis DB104 Δdal，命名为B. subtilis DBFG-1；然后，应用dal 基因替换pWB-MBM3 载体上的卡那霉素抗性基因和博来霉素抗性基因，构建pWB-DMBM3 转化入B. subtilis DBFG-1感受态细胞，获得manBl(I91N/L211I)基因食品级表达菌株 B. subtilis FGYM102。工程菌株 B. subtilis DB104 (pWB980)、B. subtilis MTV13 和B. subtilis FGYM102 在相同条件下进行发酵4 d 后，对发酵液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳，检测胞外蛋白的分泌情况，结果见图1a。由图1a 可以发现，对照菌株B. subtilis DB104 (pWB980)未检测到约39 kDa 的目的条带（泳道1），β-甘露聚糖酶表达菌株MTV13 和FGYM102都检测到了约39 kDa 的目的条带（泳道2 和泳道3），说明β-甘露聚糖酶在枯草芽孢杆菌中进行了良好表达和分泌，且抗生素表达系统和食品级表达系统的表达及分泌无明显差别。由于抗生素滥用会对生物安全性造成威胁，因此构建无抗生素标记的食品级表达系统已成为一种趋势，如对D-阿洛酮糖3-表位酶（DPease）及含铁脲酶（Bp-Urease）的食品级表达[18,20,38]，而关于β-甘露聚糖酶的食品级表达尚未见其他报道。

为便于对β-甘露聚糖酶酶学性质进行研究，对ManBl 及突变体ManBl(I91N/L211I)进行了纯化，结果如图1b 所示。

从图1b 可见，条带单一，蛋白纯化效果好，可用于后续酶学属性分析。

2.3 β-甘露聚糖酶及其突变体的酶学性质

按照1.3.5 节实验方法，考察了β-甘露聚糖酶ManBl 及突变体ManBl(I91N/L211I)的酶学性质，结果见图2。可以看出，最适温度60 ℃、最适pH 为6.0（图2a 和c）。ManBl 和突变体ManBl(I91N/L211I)在不同温度下的相对酶活性相差不明显（图2a）；二者在70 ℃孵育30 min，剩余酶活性分别为75%和50%（图2b），说明突变体ManBl(I91N/L211I)的热稳定性较对照组有所降低，该结果与I-mutant 2.0 预测结果一致[39]，I91N 和L211I 的自由能变化（ΔG），即DDG，分别为–8.2 和–5.4 kJ/mol，说明突变体热稳定性降低。

在pH 4～10 下，37 ℃孵育60 min，突变体ManBl(I91N/L211I)的pH 稳定性均高于ManBl，特别是在pH 5～10 下，突变体ManBl(I91N/L211I)的剩余相对酶活性均高于80%（图2c），说明该突变体的pH 稳定性提高。为研究酶的激活剂和抑制剂，7 种10 mmol/L 金属离子（K+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Na+、Cu2+、Mg2+）逐一加入酶缓冲液液中，结果表明，7种金属离子对突变体ManBl(I91N/L211I)的活性均有所抑制，Cu2+、Ca2+、Zn2+抑制了将近40%的相对酶活性（图2d）。

在最适条件下，测得ManBl 和突变体ManBl(I91N/L211I) 的比酶活性分别为 3750.0 和15554.7 U/mg，突变体ManBl(I91N/L211I)的比酶活性是野生型的4.1 倍。分子进化是提高酶活性的有效策略，这与其他研究结果一致[2,12]，如来源于Bacillus sp.MK-2 的β-甘露聚糖酶在T112R、L211I 或K291E 的3 个氨基酸残基单位点突变均能提高其酶活性[2]，且在3 个氨基酸位点的联合突变使其酶活性提高至9003 U/mg，均高于单氨基酸位点或双氨基酸位点的酶活性[12]。

2.4 β-甘露聚糖酶及其突变体的分子动力学及分子对接

本文的β-甘露聚糖酶ManBl 与B. licheniformis DSM13 的β-甘露聚糖酶ManB 的氨基酸序列相似性为100%[1,40]，与BCman-GH26（PDB 编码：2QHA）一致性达82.14%，以此为基础进行同源建模预测β-甘露聚糖酶的三维结构，图3 为ManBl 及突变体ManBl(I91N/L211I)动力学过程的方根偏差（RMSD）曲线，RMSD 体现蛋白质原始构象与在特定时间其结构的平均偏差。

从图3 可知，2 种蛋白的RMSD 波动均较为平缓，尤其是20 ns 后，野生型和突变体RMSD 均趋于稳定。但比较而言，野生型ManBl 的RMSD 波动较小，最后稳定在 0.20 nm 附近，而突变体ManBl(I91N/L211I)的RMSD 波动较大，最后稳定在0.25 nm 附近。结果表明，突变位点的引入使蛋白构象波动较大，即柔性更大。较大的柔性可能使酶分子具有更高的催化活力，但同时其结构紧凑型、稳定性会受到一定程度的影响。

回旋半径（Rg）代表蛋白整体结构的紧凑程度。图4 为ManBl 和突变体ManBl(I91N/L211I)的Rg。

由图4 可见，突变体ManBl(I91N/L211I)的Rg略大于野生型，表明突变位点的引入在一定程度上造成蛋白结构更为松散，使其稳定性降低，但同时有可能使得底物结合口袋更为扩张、打开，有利于底物分子的进入并发生催化。

均方根波动（RMSF）代表蛋白氨基酸残基的波动情况。图5 为ManBl 及突变体ManBl(I91N/L211I)的RMSF 曲线。

由图5 可知，突变体ManBl(I91N/L211I)氨基酸残基波动整体上要高于野生型蛋白，尤其是图中红圈所示区域，且区域2、3 位于催化残基附近。说明突变位点的引入虽然不直接作用于底物分子的结合，但其可以通过远程作用，间接导致催化口袋区域柔性增加。而结合口袋柔性的增加，与酶活力提高有显著正相关性。事实上，酶的催化区域正是因为具有柔性构象，才能更好容纳底物分子，发挥催化活性。但是该柔性的增加，在提高催化活性的同时，有可能导致热稳定性的降低。该分子动力学预测结果与实验结果一致，即突变体ManBl(I91N/L211I)催化活性较野生型提高，但热稳定性降低（图2b）。

应用Autodock 软件预测了酶与底物的对接情况，结果见图6。

由图6 可知，野生型 ManBl 与突变体ManBl(I91N/L211I)与底物结合自由能为分别为–24.7和–26.4 kJ/mol，说明突变体与底物的结合能力强于野生型，这可能是双点突变的引入使活性口袋发生柔性运动，相比野生型，突变体ManBl(I91N/L211I)口袋更开阔，能够更好地容纳底物分子，产生更强的结合能力，并最终导致催化活性提高。

2.5 β-甘露聚糖酶的产量

为了获得β-甘露聚糖酶的产量，对β-甘露聚糖酶工程菌株B. subtilis MTV13 和食品级β-甘露聚糖酶突变体ManBl(I91N/L211I)的工程菌株FGYM102 进行了发酵，并在不同时间测定其酶活性，结果见图7。

由图7 可知，ManBl及突变体ManBl(I91N/L211I)对β-甘露聚糖酶的酶活性随发酵时间的不同而不同，在1～4 d，酶活性随发酵时间延长而增加，B. subtilis MTV13 和B. subtilis FGYM102 的最高酶活性分别为5882.3 和17601.3 U/mL。

2.6 KGM 水解产物分析

应用 ManBl 或突变体 ManBl(I91N/L211I)在60 ℃水解KGM 30 min，二者形成的甘露寡糖组成及质量分数见图8。

由图8a 和b 可见，β-甘露聚糖酶突变体的催化性质并没有发生变化。

由图8 a 可知，当ManBl 添加量由0.5 U/mL 增至50 U/mL 时，形成的MOS 质量分数约80%。由图8 b 可知，ManBl(I91N/L211I)添加量由0.5 U/mL 增至50 U/mL 时，形成的MOS 质量分数提高到85%，且形成的MOS 主要为DP6（6 为聚合度，下同）、DP3 和DP2。酶添加量增加时，水解形成的DP6 质量分数下降，而水解形成的DP3 和DP2 质量分数增加，如应用0.5 U/mL 突变体ManBl(I91N/L211I)水解KGM 时，所形成的DP6 和DP3 为总MOS 的90.8%和7.6%，应用50 U/mL 的突变体ManBl(I91N/L211I)时，DP6 和DP3 为总MOS 的75.1%和15.5%，这表明，DP6 可进一步被水解为DP3 或DP2，导致DP6所占MOS 的比例下降而DP3 所占MOS 比例增加。结果表明，ManBl 或突变体ManBl(I91N/L211I)为内切水解酶，与前人研究结果一致[1]。

由于β-甘露聚糖酶用量0.5 与50 U/mL 时，水解KGM 所形成的MOS 总量变化不大，为降低制备MOS 成本，节约酶用量，进一步探究了β-甘露聚糖添加量为0.5 U/mL 时，延长酶反应时间（1～6 h）水解KGM 的情况见图8c 和图8d。由图8c 可知，当ManBl 用量为0.5 U/mL 时，当水解时间由1 h延长至6 h 时，形成的MOS 质量分数由84.5%增至88.9%。当突变体 ManBl(I91N/L211I)添加量 0.5 U/mL，在1～6 h 内，水解KGM 形成的MOS 占总水解产物的86%（图8d），与应用添加50 U/mL 的酶水解30 min 所形成的MOS 质量分数（图8b）无明显区别，所形成的MOS 质量分数并没有随孵育时间延长而增加。从经济角度出发，以KGM 为原材料制备 MOS 时，建议应用 0.5 U/mL 突变体ManBl(I91N/L211I) 60 ℃水解1 h。

本研究的 β-甘露聚糖酶 ManBl 或突变体ManBl(I91N/L211I)对KGM 水解形成的MOS，与前人应用β-甘露聚糖酶ManB 对刺槐豆胶（LBG）的研究结果类似，ManB能够水解聚合度>6的甘露聚糖[1]，形成甘露四糖、甘露三糖和甘露二糖；本研究报道的β-甘露聚糖酶性质与β-甘露聚糖酶MEIR 水解KGM性质不同，MEIR 水解KGM 所形成的MOS，79.07%为DP7-12 的寡甘露糖[12]。

3 结论

（1）获得的 β-甘露聚糖酶突变体 ManBl(I91N/L211I)，首次在枯草芽孢杆菌中实现了食品级表达，比酶活性为15554.7 U/mg，为其在食品加工、饲料等领域的安全应用奠定了基础。

（2）尽管ManBl(I91N/L211I)突变体使酶的热稳定性有一定程度降低，但2 个氨基酸位点位于酶的催化中心之外，该突变使突变体蛋白柔性结构增加，与底物能够更好结合，是使酶活性有很大提高的主要原因。

（3）应用ManBl(I91N/L211I)水解KGM 制备MOS 时，可在60 ℃、pH 6、0.5 U/mL 的酶、酶解1 h 的条件下进行，制备得到的MOS 质量分数达86%。

参考文献：

[1] SONGSIRIRITTHIGUL C, BURANABANYAT B, HALTRICH D,et al.Efficient recombinant expression and secretion of a thermostable GH26 mannan endo-1,4-beta-mannosidase from Bacillus licheniformis in Escherichia coli[J].Microbial Cell Factories, 2010, 9: 20.

[2] ZHANG W, LIU Z M, ZHOU S J, et al.Cloning and expression of a β-mannanase gene from Bacillus sp.MK-2 and its directed evolution by random mutagenesis[J].Enzyme and Microbial Technology, 2019,124: 70-78.

[3] WU G, BRYANT M M, VOITLE R A, et al.Effects of betamannanase in corn-soy diets on commercial leghorns in second-cycle hens[J].Poultry Science, 2005, 84(6): 894-897.

[4] ANGURAL S, BALA I, KUMAR A, et al.Bleach enhancement of mixed wood pulp by mixture of thermo-alkali-stable xylanase and mannanase derived through co-culturing of alkalophilic Bacillus sp.NG-27 and Bacillus nealsonii PN-11[J].Heliyon, 2021, 7(1): e05673.

[5] SINGH S, SINGH G, KHATRI M, et al.Thermo and alkali stable β-mannanase: Characterization and application for removal of food(mannans based) stain[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2019, 134: 536-546.

[6] SACHSLEHNER A, FOIDL G, FOIDL N, et al.Hydrolysis of isolated coffee mannan and coffee extract by mannanases of Sclerotium rolfsii[J].Journal of Biotechnology, 2000, 80(2): 127-134.

[7] LIU H X, GONG J S, LI H, et al.Biochemical characterization and cloning of an endo-1,4-β-mannanase from Bacillus subtilis YH12 with unusually broad substrate profile[J].Process Biochemistry,2015, 50(5): 712-721.

[8] KALIDAS N R, SAMINATHAN M, ISMAIL I S, et al.Structural characterization and evaluation of prebiotic activity of oil palm kernel cake mannanoligosaccharides[J].Food Chemistry, 2017, 234:348-355.

[9] DEVARAJ R D, REDDY C K, XU B J.Health-promoting effects of konjac glucomannan and its practical applications: A critical review[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2019,126: 273-281.

[10] KATROLIA P, ZHOU P, ZHANG P, et al.High level expression of a novel β-mannanase from Chaetomium sp.exhibiting efficient mannan hydrolysis[J].Carbohydrate Polymers, 2012, 87(1): 480-490.

[11] DAWOOD A, MA K.Applications of microbial β-mannanases[J].Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2020, 8: 598630.

[12] LIU Z M, NING C, YUAN M X, et al.High-efficiency expression of a superior β-mannanase engineered by cooperative substitution method in Pichia pastoris and its application in preparation of prebiotic mannooligosaccharides[J].Bioresource Technology, 2020,311: 123482.

[13] SRIVASTAVA P K, APPU RAO G A R, KAPOOR M.Metaldependent thermal stability of recombinant endo-mannanase (ManB-1601) belonging to family GH 26 from Bacillus sp.CFR1601[J].Enzyme and Microbial Technology, 2016, 84: 41-49.

[14] NGUYEN H M, PHAM M L, STELZER E M, et al.Constitutive expression and cell-surface display of a bacterial β-mannanase in Lactobacillus plantarum[J].Microbial Cell Factories, 2019, 18(1):76.

[15] LIU J Q, BASIT A, MIAO T, et al.Secretory expression of β-mannanase in Saccharomyces cerevisiae and its high efficiency for hydrolysis of mannans to mannooligosaccharides[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2018, 102(23): 10027-10041.

[16] XIA Y, CHEN W, ZHAO J X, et al.Construction of a new food-grade expression system for Bacillus subtilis based on theta replication plasmids and auxotrophic complementation[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 76(3): 643-650.

[17] HE W W, MU W M, JIANG B, et al.Food-grade expression of D-psicose 3-epimerase with tandem repeat genes in Bacillus subtilis[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2016, 64(28):5701-5707.

[18] LIU Q T, JIN X R, FANG F, et al.Food-grade expression of an iron-containing acid urease in Bacillus subtilis[J].Journal of Biotechnology, 2019, 293: 66-71.

[19] LIU Y F, LIU L, LI J H, et al.Synthetic biology toolbox and chassis development in Bacillus subtilis[J].Trends in Biotechnology, 2019,37(5): 548-562.

[20] CHEN J Q, JIN Z X, GAI Y M, et al.A food-grade expression system for d-psicose 3-epimerase production in Bacillus subtilis using an alanine racemase-encoding selection marker[J].Bioresources and Bioprocessing, 2017, 4(1): 9.

[21] WU S C, WONG S L.Development of improved pUB110-based vectors for expression and secretion studies in Bacillus subtilis[J].Journal of Biotechnology, 1999, 72(1/2): 185-195.

[22] KAWAMURA F, DOI R H.Construction of a Bacillus subtilis double mutant deficient in extracellular alkaline and neutral proteases[J].Journal of Bacteriology, 1984, 160(1): 442-444.

[23] WU Y K, LIU Y F, LV X Q, et al.CAMERS-B: CRISPR/Cpf1 assisted multiple-genes editing and regulation system for Bacillus subtilis[J].Biotechnology and Bioengineering, 2020, 117(6): 1817-1825.

[24] TIAN G (田庚), GAO W Q (高伟强), CHEN X B (陈晓波), et al.Directed Mutagenesis of β-mannanase gene from Bacillus licheniformis KD-1 for improving enzyme activity and stability[J].Biotechnology Bulletin (生物技术通报), 2021, 37(10): 100-109.

[25] YOU C, ZHANG X Z, ZHANG Y H P.Simple cloning via direct transformation of PCR product (DNA Multimer) to Escherichia coli and Bacillus subtilis[J].Applied and Environmental Microbiology,2012, 78(5): 1593-1595.

[26] VOJCIC L, DESPOTOVIC D, MARTINEZ R, et al.An efficient transformation method for Bacillus subtilis DB104[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 94(2): 487-493.

[27] HAEUSSLER M, SCHÖNIG K, ECKERT H, et al.Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR[J].Genome Biology, 2016,17(1): 148.

[28] ZETSCHE B, GOOTENBERG J S, ABUDAYYEH O O, et al.Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system[J].Cell, 2015, 163(3): 759-771.

[29] MILLER G L.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J].Analytical Chemistry, 1959, 31(3): 420-428.

[30] TEUFEL F, ALMAGRO ARMENTEROS J J, JOHANSEN A R,et al.SignalP 6.0 predicts all five types of signal peptides using protein language models[J].Nature Biotechnology, 2022, 40(7):1023-1025.

[31] BLUM M, CHANG H Y, CHUGURANSKY S, et al.The InterPro protein families and domains database: 20 years on[J].Nucleic Acids Research, 2021, 49(D1): D344-D354.

[32] YAN X X, AN X M, GUI L L, et al.From structure to function:Insights into the catalytic substrate specificity and thermostability displayed by Bacillus subtilis mannanase BCman[J].Journal of Molecular Biology, 2008, 379(3): 535-544.

[33] WEBB B, SALI A.Protein structure modeling with MODELLER[J].Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 2021, 2199: 239-255.

[34] RAKHSHANI H, DEHGHANIAN E, RAHATI A.Enhanced GROMACS: Toward a better numeric framework al simulation[J].Journal of Molecular Modeling, 2019, 25(12): 355.

[35] EBERHARDT J, SANTOS-MARTINS D, TILLACK A F, et al.AutoDock Vina 1.2.0: New docking methods, expanded force field,and Python bindings[J].Journal of Chemical Information and Modeling, 2021, 61(8): 3891-3898.

[36] PORTER J L, RUSLI R A, OLLIS D L.Directed evolution of enzymes for industrial biocatalysis[J].Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology, 2016, 17(3): 197-203.

[37] BRON P A, BENCHIMOL M G, LAMBERT J, et al.Use of the alr gene as a food-grade selection marker in lactic acid bacteria[J].Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(11): 5663-5670.

[38] HE W W, MU W M, JIANG B, et al.Construction of a food grade recombinant Bacillus subtilis based on replicative plasmids with an auxotrophic marker for biotransformation of D-fructose to D-allulose[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2016,64(16): 3243-3250.

[39] CAPRIOTTI E, FARISELLI P, CASADIO R.I-Mutant 2.0:Predicting stability changes upon mutation from the protein sequence or structure[J].Nucleic Acids Research, 2005, 33 (Web Server issue):W306-W310.

[40] SONGSIRIRITTHIGUL C, LAPBOONRUENG S, ROYTRAKUL S, et al.Crystallization and preliminary crystallographic analysis of β-mannanase from Bacillus licheniformis[J].Acta Crystallographica Section F-Structural Biology and Crystallization Commol/Lunications,2011, 67(Part 2): 217-220.