中药现代化技术

竹节参多糖通过PI3K/AKT/NF-κB 信号通路对急性肝损伤大鼠的影响

宋添力1,2，唐 浪1，王一民1，吴广阳1,3，刘 绪1，黄 胜1,2*

（1.湖北民族大学 医学部，湖北 恩施 445000；2.湖北民族大学 风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000；3.湖北恩施学院，湖北 恩施 445000）

摘要：以竹节参（Panax japonicus）为原料，经水提醇沉法制备了竹节参多糖（PSPJ），通过观察和记录大鼠一般情况及肝脏指数（肝脏质量/体质量）探讨了PSPJ 通过PI3K/AKT/NF-κB 信号通路干预CCl4 诱导的急性肝损伤（ALI）大鼠的作用机制；采用苏木素-伊红（H&E）染色法评价了PSPJ 对肝组织病理变化的改善作用；采用免疫组织化学（IHC）染色检测了肝脏组织NF-κB 的表达情况；通过蛋白免疫印迹（Western blot）检测考察了PSPJ 对ALI 大鼠肝脏PI3K/AKT/NF-κB 信号通路相关蛋白及炎症指标的表达水平。结果表明，与空白对照组相比，模型组的体质量、肝脏质量和肝脏指数均显著上升（P<0.05，表示差异有统计学意义，下同），模型组出现大量肝组织炎症浸润，用药组肝脏病理变化明显缓解；与空白对照组比较，模型组大鼠肝组织p-PI3K 蛋白表达显著下降（P<0.01），PI3K、p-AKT、p-NF-κB、IL-1β 蛋白表达显著升高（P<0.05）；药物组p-PI3K 蛋白表达显著上升（P<0.05），p-AKT、IL-1β 蛋白表达显著下降（分别为P<0.01、P<0.05）。PSPJ 通过PI3K/AKT/NF-κB通路信号中的相关关键蛋白表达减轻了CCl4 诱导的大鼠ALI 症状。

关键词：竹节参多糖；PI3K/AKT/NF-κB；急性肝损伤；抗氧化；抗炎；中药现代化技术

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：1003-5214 (2023) 11-2472-08

收稿日期：2023-08-21; 定用日期：2023-09-28;

DOI: 10.13550/j.jxhg.20230697

基金项目：湖北省自然科学基金青年项目（2019CFB358）；国家自然科学基金青年基金项目（81801979）

作者简介：宋添力（1998—），男，硕士生，E-mail：stl15234839197@163.com。联系人：黄 胜（1987—），男，讲师，E-mail：hs19870604@163.com。

Effect of Panax japonicus polysaccharide on acute liver injury rats via PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway

SONG Tianli1,2, TANG Lang1, WANG Yiming1, WU Guangyang1,3, LIU Xu1, HUANG Sheng1,2*
（1.Medical School, Hubei Minzu University, Enshi 445000, Hubei, China; 2.Hubei Provincial Key Laboratory of Occurrence and Intervention of Rheumatic Diseases, Hubei Minzu University, Enshi 445000, Hubei, China; 3.Hubei Enshi College, Enshi 445000, Hubei, China）

Abstract: Panax japonicus polysaccharide (PSPJ), prepared via water extraction and alcohol precipitation,was used for treatment of rats with CCl4-induced acute liver injury (ALI).The mechanism of PSPJ's intervention on the injury through PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway was analyzed by observing and recording the general condition and liver index (liver mass/body mass) of rats.The effects of PSPJ on the pathological changes of liver tissue were evaluated by hematoxylin-eosin (H&E) staining,immunohistochemical (IHC) staining for the liver NF-κB expression, and protein immunoblotting (Western blot) analysis on the expression levels of PSPJ on PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway related proteins and inflammatory indexes in ALI rats.The results showed that compared with the blank control group, the model group exhibited significant increment in the body mass, liver mass as well as liver index (P<0.05,indicating statistical significance, the same below), and a large number of liver tissue inflammatory infiltration, while the drug treated group displayed obvious relief in the liver pathological changes.Compared with the blank control group, the protein expression of p-PI3K in liver tissue of model group was significantly decreased (P<0.01), while the protein expressions of PI3K, p-AKT, p-NF-κB and IL-1β were significantly increased (P<0.05).In drug treated group, the expression of P-PI3K protein was significantly increased (P<0.05), and the expression of p-AKT and IL-1β protein was significantly decreased (P<0.01,P<0.05).Therefore, PSPJ alleviated CCl4-induced ALI symptoms in rats through the expression of related key proteins in the PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway.

Key words: Panax japonicus polysaccharide; PI3K/AKT/NF-κB; acute liver injury; oxidation resistance;anti-inflammatory; modernization technology of traditional Chinese medicines

肝脏作为人体最大的实体器官，在物质代谢、血容量调节、内分泌控制、脂质维持和胆固醇稳态以及免疫系统支持中起着重要的作用[1-2]。然而，病毒、药物、酒精、免疫损伤等多种肝毒性因素可引发肝细胞损伤和死亡[3-4]。急性肝损伤（ALI）是指短时间内引发肝细胞受损的一种疾病，包括药物性肝损伤、急性病毒性肝炎、急性酒精性肝损伤、急性创伤等，严重情况下可迅速发展成为急性肝衰竭（ALF），严重威胁着人体健康[5]。研究表明，大多数的ALF 是由于药物及细菌耐药性引起的肝损伤进一步发展而成，其发病率和死亡率都很高，临床上肝移植才能有效治疗和缓解ALF 中末期[6-8]。目前，ALF 尚缺乏特效的治疗药物，一般是病因治疗、抗炎、抗病毒、降酶、退黄以及免疫调节治疗，严重者则需要进行肝移植、人工肝等[9]。迄今为止，肝移植是治疗ALF 最有效的方法[10-11]。然而，由于肝源稀缺和肝移植技术的局限性，肝移植手术的成功率较低，对症治疗只能暂时缓解症状，仍影响患者的生活质量；手术疗法则费用较高、适配性较小，预后极差。因此，ALI 已成为世界范围内的公共卫生问题[12]，研究开发预防或治疗ALI 的有效药物对于缓解肝病及重症具有重要意义。

竹节参，又称为“竹节人参”、“白三七”或“七叶子”，五加科人参属植物竹节参（Panax japonicus C.A.Mey）的干燥根茎，始载于赵学楷所撰的《百草镜》，其性温，味甘、微苦，归肝、脾、肺经，具有散瘀止血，消肿止痛、滋补强壮、祛风除湿的功效，主要分布在湖北、贵州及四川等地，其中，湖北恩施最为丰富，是恩施道地药材，土家珍稀名贵的“七”类药材之一[13]。周静等[14]研究表明，竹节参的主要活性成分为糖类、皂苷类、核苷类、氨基酸类、挥发油类及无机盐类等，具有保肝、促进消化、镇静、抗疲劳、降血脂、改善睡眠、保护心脑血管、调节免疫、抗炎镇痛、抗肿瘤等作用。本课题组前期研究发现[15]，以竹节参为主药的道地中成药复方竹节参片对于肝损伤具有潜在的治疗靶点，并预测了其潜在活性成分对于PI3K/AKT 通路和NF-κB 信号通路上的关键蛋白尤为敏感，为复方竹节参片治疗肝损伤提供了一定的理论参考。

本课题组前期研究表明[16]，氧化应激和炎症反应是肝损伤的主要致病因素，竹节参多糖（PSPJ）可以通过激活Nrf2-ARE 信号通路增强抗氧化酶的活力而发挥抗氧化作用，进而改善肝损伤症状。PI3K/AKT/NF-κB 信号传导与氧化应激和炎症反应密切相关[17]。然而，PSPJ 是否对肝损伤治疗中的PI3K/AKT/NF-κB 信号传导发挥抗炎和抗氧化作用仍然未知。因此，本研究旨在探讨PSPJ 对CCl4 诱导的ALI 的改善作用，并从PI3K/AKT/NF-κB 角度探讨其作用机制，为临床上开发天然药物治疗ALI提供深入的理论依据和可靠的实验数据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

竹节参，湖北省宣恩县椿木营竹节参培育种植基地，经湖北民族大学文德鉴副教授鉴定为五加科植物竹节参的干燥根茎；CCl4，化学纯，上海麦克林生化科技股份有限公司；多聚甲醛，分析纯，北京兰杰柯科技有限公司；HRP 标记的山羊抗小鼠IgG 抗体、H&E 染色试剂盒、牛血清白蛋白（BSA）、枸橼酸盐、BCA 蛋白质试剂盒、一抗稀释液、二抗稀释液，上海碧云天生物技术有限公司；IHC 试剂盒、SABC-POD 试剂盒（1/2KIT）、DAB 显色试剂盒、磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2），武汉博士德生物工程有限公司；联苯双酯滴丸，北京协和药厂；双蒸水，恩施州华圩科技有限公司；二甲苯，分析纯，南京化学试剂股份有限公司；无水乙醇（分析纯）、乌拉坦（分析纯）、TBST 缓冲液，默克生命科学有限公司；PI3K 抗体、GAPDH 抗体，美国界面蛋白质技术公司；磷酸化PI3K（p-PI3K）抗体，美国CST 公司；AKT 抗体，美国SAB 公司；磷酸化AKT 抗体、NF-κB 抗体、磷酸化NF-κB 抗体、IL-1β抗体，沈阳万类生物科技有限公司；HRP 标记的山羊抗兔IgG 抗体、ELC 发光液，武汉科瑞科技有限公司。

1510-01611C 型全波长酶标仪、A44116 型凝胶成像系统、Fluor Chem E 凝胶成像系统，美国Thermo Fisher Scientific 公司；VT1200S 型石蜡切片机，德国LeicaBiosystems 公司；E100 型正置光学显微镜，日本Nikon 公司；B212AT04E 型电泳及转膜系统，美国Bio-Rad 公司；BT25S 型高精度天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；5811 型高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司。

1.2 方法

1.2.1 PSPJ 制备及质量分数测定

将竹节参置于37 ℃烘箱中干燥6 h，然后用中药粉碎机进行粉碎，取20 g 粉碎后竹节参室温下用400 mL 体积分数95%乙醇浸泡48 h，其中固液比（g∶mL）为1∶20；接着，将其加热回流2 h，过滤，取滤渣；然后，重复以上回流步骤，分别在400 mL 体积分数80%乙醇及400 mL 双蒸水下回流，收集滤液，将滤液或经旋转蒸发仪浓缩（50 ℃）至体积为滤液体积的50%（或20%）后，用氯仿-异戊醇（体积比24∶1）溶液脱蛋白〔V(滤液或浓缩液)∶V(氯仿-异戊醇)=5∶1〕充分混合、高速冷冻离心机离心（4 ℃，12000 r/min，10 min）；脱蛋白离心结束后，小心吸取上清液，将其缓慢加入到快速搅拌下的4 倍体积的体积分数80%乙醇中进行醇沉；然后，置于4 ℃冰柜中放置12 h；过滤、收集沉淀，将沉淀在37 ℃下干燥60 min，即得1.462 g PSPJ，提取率为7.31%（提取率/%=提取物质量/生药用量×100）。运用苯酚-硫酸法测定PSPJ 质量分数[18]：配制质量浓度为0.0758 g/L 的PSPJ 待测液，经葡萄糖标准线性回归方程y=3.39x+0.004（R2=0.9976）计算得PSPJ 待测液中糖质量浓度为0.0696 g/L，即得PSPJ 的中性多糖的质量分数为91.8%（质量分数/%=测定的待测液质量浓度/配制的待测液质量浓度×100）。

1.2.2 ALI 大鼠分组、造模与给药

目前，常用的ALI 动物模型有CCl4、对乙酰氨基酚（APAP）、α-萘异硫氰酸酯（ANIT）、D-氨基半乳糖/脂多糖（D-GalN/LPS）和3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢-2,4,6-三甲基吡啶（DDC）5 种动物模型。CCl4 诱导ALI 模型简便易操作、可重复性好、死亡率较低，与人类肝脏疾病在病理生理方面上相似度更高，是经典的化学性肝损伤模型，因此，本文采用CCl4 诱导法进行造模[19-20]。

实验动物为SPF 级SD 雄性大鼠50 只，6 周龄（辽宁长生生物技术股份有限公司），体质量(200±20) g，适应性喂养7 d 后开始实验。饲养在温度(24±2)℃、相对湿度55%～65%、12 h 光照/12 h 黑暗的环境中，自由饮水进食。动物实验设计得到湖北民族大学伦理委员会批准〔（2021）57〕。

将SD 大鼠随机分为6 组：空白对照组、模型组（CCl4 诱导，未用药）、联苯双酯（LBSZ，100 mg/kg，以SD 大鼠体质量为基准，下同）组、PSPJ低剂量（50 mg/kg）组、PSPJ 中剂量（100 mg/kg）组、PSPJ 高剂量（200 mg/kg）组，每组5 只。根据《中国药典》[18]中竹节参成人生药剂量（6～9 g）与“实验动物与人的体表面积换算关系”进行计算，最终按照1∶2∶4 给药量分为PSPJ 低剂量组50 mg/kg、中剂量组100 mg/kg、高剂量组200 mg/kg。空白对照组腹腔注射生理盐水，其余5 组大鼠在第1、4、7 d 注射质量分数为12%的CCl4 生理盐水溶液，注射量为5 mL/kg。除空白对照组和模型组大鼠灌胃生活饮用水外，其余4 组大鼠灌胃相应浓度的药物，灌胃体积为5 mL/kg，每天2 次。第7 d 给药结束后，晚上禁食不禁水>12 h，次日麻醉收集大鼠肝脏组织。

1.2.3 样本的采集及处理

称大鼠的体质量并记录，按照6 mL/kg 的剂量腹腔注射质量浓度200 g/L 乌拉坦水溶液对大鼠进行麻醉后收集血液，离心（4 ℃，4000 r/min，15 min），分离血清进行检测。取出肝脏组织，用滤纸吸干后称其质量，作为肝脏质量。

1.2.4 大鼠行为学变化

观察各组大鼠的行为学变化以及一般情况，如饮食、大小便、毛发、运动量、精神状态等。

1.2.5 大鼠体质量及肝脏指数计算

每天对大鼠进行称重并记录其体质量变化，按式（1）计算肝脏指数：

式中：I 为肝脏指数，%；m1 为肝脏质量，g；m0 为大鼠体质量，g。

1.2.6 苏木素-伊红（H&E）染色

取大鼠肝组织用多聚甲醛固定24 h，大鼠肝组织的质量分数为4%，经脱水、透明、浸蜡、包埋后用石蜡切片机制成厚度5 μm 左右的切片，然后H&E染色，最后用中性树胶封片，在正置光学显微镜下观察肝脏组织的病理变化并采集病理图片。

1.2.7 免疫组织化学（IHC）染色检测

肝组织脱水：脱水用的乙醇体积分数从70%→75%→80%→90%→95%（各1 h）→无水乙醇（30 min）→无水乙醇（30 min），即由低体积分数逐步到高体积分数包埋后制成蜡块，将包埋组织的蜡块固定在切片机上，修块，切片（厚度5 μm），经二甲苯脱蜡3 次，每次5 min。然后经过无水乙醇（体积分数95%、85%、75%）复水，每梯度1 min，双蒸馏水浸泡1 min，用PBS 洗涤后，用SABC-POD试剂盒淬灭失活组织内源性过氧化物酶，再经枸橼酸盐进行抗原修复，质量分数5%的牛血清白蛋白抗原封闭；一抗、二抗孵育，DAB 显色试剂盒显色后进行苏木素复染，同上步骤经梯度乙醇、二甲苯脱水，中性树脂封片后正置光学显微镜下观察拍照。

1.2.8 蛋白免疫印迹检测

蛋白免疫印迹（Western blot）检测 PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、NF-κB、p-NF-κB、IL-1β蛋白的表达水平。

将大鼠肝组织通过匀浆、变性和超声提取样本总蛋白，用BCA 蛋白质试剂盒测量蛋白质浓度以确定上样量。配制聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶，并对蛋白质进行上样、电泳、转膜、封闭，然后将膜与用一抗稀释液稀释好的一抗（检测蛋白的抗体）在4 ℃孵育12 h，一抗包括PI3K（体积比1∶1000）、p-PI3K（体积比1∶1000）、AKT（体积比1∶1000）、p-AKT（体积比1∶500）、NF-κB（体积比1∶2000）、p-NF-κB（体积比1∶2000）、IL-1β（体积比1∶1000）和GAPDH（体积比1∶2000）；将膜与用二抗稀释液稀释好二抗（体积比1∶10000）在室温下孵育1 h，再次用TBST 缓冲液洗涤3 次，吸干多余水分；用化学发光试剂检测抗原-抗体复合物，Fluor Chem E 凝胶成像系统捕获图像，并使用Image J 软件进行凝胶图像分析。

1.2.9 统计学分析

采用SPSS 25.0 统计软件进行统计数据并分析结果，计量数据以均数±标准差（±s）表示，样品数n=5；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD 检验，若不符合正态分布采用非参数检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。利用Origin 2022 软件进行制图。

2 结果与讨论

2.1 PSPJ 对ALI 大鼠一般情况和体征的影响

实验期间，空白对照组大鼠毛色光滑，动作灵敏，反应迅速，食欲佳，大便正常，无异常反应出现；而模型组大鼠在造模后出现精神萎靡，活动减少，毛色杂乱泛黄无光泽，经常出现弓背现象；空白对照组大鼠反应迅速，动作灵敏，皮毛整洁有光泽；模型组大鼠活动较少，皮毛油腻；LBSZ 组和PSPJ 各剂量给药组相对模型组一般情况均有不同程度缓解和好转，其中，LBSZ 组和PSPJ 高剂量组干预后观察到上述体征改善最为明显。

2.2 PSPJ 对ALI 大鼠体质量及肝脏指数的影响

图1 为6 组大鼠体质量随时间的变化趋势。由图1 可知，空白对照组大鼠在正常喂养条件下，体质量相对稳定；模型组大鼠由于体内炎症及腹水的不断增多，体质量大体上持续上升。PSPJ 中、高剂量组及LBSZ 组大鼠体质量先有所增加，后又恢复正常，可能是由于用药之后身体炎症及腹水减轻所致。由于天然多糖具有较高的生物安全性、生物降解性及多种生物活性，可以通过相关的信号通路来调节炎症[21]，如铁皮石斛多糖[22]可以抑制NLRP3炎症小体的表达，降低促炎细胞因子（IFN-γ、IL-1β、IL-6）的表达；黄芪多糖[23]可以降低促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、IFN-γ）和肿瘤坏死因子(TNF)-α 的表达。

PSPJ 是通过抑制丙二醛的产生、降低一氧化氮水平、增加超氧化物歧化酶的数量达到抑制炎症的作用[24]。

由表1 可知，与空白对照组相比，模型组体质量、肝脏质量和肝脏指数均显著上升（P<0.05），证明模型的有效性。这是由于CCl4 作为一种肝毒性化学试剂，影响DNA 和细胞膜，导致脂质氧化降解，激发肝组织的氧化应激，刺激肝细胞分泌大量炎症因子，进而刺激免疫相关细胞产生大量介质诱导局部炎症反应，激活半胱氨酸吸入蛋白酶，并导致细胞凋亡，所以出现大量腹水及炎症[25-26]；与模型组比较，PSPJ 低剂量组、PSPJ 中剂量组、PSPJ 高剂量组体质量、肝脏质量和肝脏指数均降低，表明PSPJ 通过降低氧化应激，增强抗氧化能力，从而达到抑制肝脏炎症反应，对急性肝炎有一定的治疗效果。尤其是PSPJ 高剂量组和LBSZ 组体质量、肝脏质量和肝脏指数水平显著降低，具有统计学意义。此外，PSPJ 高剂量组效果接近于LBSZ 组。LBSZ作为治疗肝炎的降酶药物，可以通过诱导低黑色素P450 酶系活性升高以降低CCl4 代谢过程中还原性辅助酶及氧分子的消耗，达到保护肝细胞生物膜的结构和功能，减轻肝损伤[27]。

2.3 PSPJ 对ALI 大鼠肝脏病理学的影响

由图2 可知，空白对照组大鼠肝细胞排列整齐、结构完整，肝窦正常，肝索呈放射状排列，胞浆着色均匀，细胞核清晰（图2a）；模型组大鼠肝细胞可见肝细胞基本结构消失，表现为肝细胞弥漫性肿胀、碎片状坏死，肝小叶结构不清、中央实质细胞碎片状坏死，肝索排列紊乱，胞浆疏松化、内空泡样变性，肝窦隙狭窄，几近消失（图2b）。这是由于当肝细胞受到有害因素（CCl4）刺激时，机体产生过多的高活性自由分子，如活性氧（ROS）、一氧化氮合酶（NOS）等，导致氧化及抗氧化防御系统失调，产生大量的氧化空间体，导致细胞内空泡样变性、炎症浸润，炎症常波及汇管区周围小叶周边区肝细胞，引起碎屑样坏死，并在坏死边缘伴有肿胀变性的多核肝细胞[28]。与模型组相比，PSPJ 低剂量组和PSPJ 中剂量组大鼠1/3 以内肝细胞水肿，汇管区炎细胞浸润和点状坏死灶较模型组显著降低（图2c、图2d）。LBSZ 组和PSPJ 高剂量组肝组织损伤明显减轻（图2e、图2f）。LBSZ 组和PSPJ 高剂量组形态结构趋近空白对照组。结果表明，PSPJ能有效保护急性肝损伤大鼠的肝脏组织病理损伤，以PSPJ 高剂量组效果明显，说明PSPJ 可以改善CCl4 导致的肝损伤。

2.4 免疫组织化学检测分析

图3 和图4 为免疫组化检测肝组织NF-κB 的阳性表达结果。PI3K/AKT/NF-κB 信号通路的关键炎症蛋白是NF-κB，而NF-κB 作为PI3K/AKT 下游信号分子，通过IκB 激酶（IKK）链接，AKT 磷酸化后可激活下游NF-κB 转录入核，所以免疫组化检测肝组织NF-κB 的阳性表达量。

由图3 和图4 可知，空白对照组细胞核未见NF-κB 阳性；与空白对照组相比，模型组和PSPJ低剂量组大量肝细胞中NF-κB 阳性表达升高呈棕色且大多分布在细胞质和细胞核中（P<0.01），说明CCl4 诱导ALI 大鼠模型的成功；与模型组相比，LBSZ 组阳性表达均显著减少（P<0.01），PSPJ 中剂量组和高剂量组表达减少（P<0.05），说明PSPJ 可能通过作用于NF-κB 介导减轻了肝脏细胞炎症，降低NF-κB 磷酸化活性水平，进而减少下游炎症因子IL-1β、NF-κB 的表达，减轻CCl4 诱发的急性肝脏炎症反应。从组织病理学和细胞层次说明，PSPJ 可以改变CCl4 大鼠肝脏组织的病理变化。

2.5 Western blot 检测分析

图5 和图6 为Western blot 检测的结果。Western blot 检测是通过改变蛋白质的空间构象，将其变为单链结构后，进行抗原-抗体免疫反应检测其含量。此方法能准确检测不同肝脏组织样本间蛋白质的含量，从而揭示蛋白质表达量的变化。

由图5 和图6 可知，与空白对照组比较，模型组大鼠肝组织p-PI3K 蛋白表达显著下降（P<0.01），PI3K、p-AKT、p-NF-κB、IL-1β 蛋白表达显著升高（P<0.05）；与模型组比较，用药组p-PI3K 蛋白表达显著上升（P<0.05），p-AKT、IL-1β 蛋白表达显著下降（分别为P<0.01、P<0.05），显示PSPJ 可能通过增加机体的p-PI3K，抑制p-AKT、IL-1β 等炎症因子的表达，从而减轻CCl4 诱导的肝脏炎症。一般来说，PI3K 通过活化后的AKT 激活底物靶蛋白NF-κB，起到调控下游细胞增殖和炎症靶基因表达的作用，PI3K/AKT/NF-κB 信号通路是机体炎症反应的重要调节途径，可以抑制肝损伤后的炎症反应及细胞凋亡，发挥肝组织的保护作用。王文洲等[29]通过基于白细胞介素(IL)-23/辅助性 T 细胞 17（Th17）炎症轴与PI3K/AKT/NF-κB 信号轴相关性，探讨了运脾泻肺化痰汤对幼龄哮喘大鼠气道炎症、黏液高分泌的影响，结果表明，经卵清蛋白（OVA）诱导后模型组IL-17 与p-PI3K、p-AKT 及p-NF-κB蛋白表达升高，经干预后同时下降，表明IL-23/Th17炎症轴与 PI3K/AKT/NF-κB 信号通路转导存在联系。因此，Western blot 检测可以从蛋白层面证实，PSPJ 可能通过调节ALI 大鼠肝PI3K/AKT/NF-κB 信号通路相关蛋白 PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、NF-κB、p-NF-κB 的表达水平以及炎症指标IL-1β 的表达水平来减轻CCl4 诱导的大鼠ALI 症状。

PI3K/AKT/NF-κB 信号通路参与激活炎症因子，可以有效抑制CCl4 诱导的相关纤维增生、细胞因子风暴及炎症反应，从而改善CCl4 导致大鼠肝脏组织的损伤。PI3K/AKT 信号通路是由磷酸化磷脂酰肌醇-3-羟基的脂类激酶活性的PI3K 及下游AKT 组成，AKT 被磷酸化并被激活，进一步调控下游的靶基因。PI3K/AKT 作为经典的信号转导途径，参与机体的免疫应答和炎症反应，对细胞的增殖、凋亡、存活和代谢具有重要意义[30-31]。PI3K/AKT 作为ALI感染期间产生炎性介质的关键因子，可以调控包括趋化因子（RANTES）、IL-6、IL-11 等炎症因子。

当肝脏发生炎症时，PI3K/AKT/NF-κB 信号通路中的NF-κB 乙酰化，从而转录下游炎症因子，导致炎症因子加快释放及炎症介质加快合成。Westron blot 检测结果显示，PSPJ 能降低p-AKT、IL-1β 的蛋白表达，升高p-PI3K 的蛋白表达，表明PSPJ 可能通过去乙酰化修饰基因组蛋白的位点，尤其是通过NF-κB、p-NF-κB 抑制基因转录，下调炎症因子的表达，发挥抗炎的作用。PI3K/AKT/NF-κB 通路的激活来改善ALI。QIU 等[32]研究表明，竹节参总皂苷在体内和体外通过p62 核因子E2 相关因子2（Nrf2）途径和腺苷酸活化蛋白激酶-乙酰辅酶A 羧化酶/过氧化物酶体增殖物激活受体（AMPK-ACC/PPAR）轴缓解急性酒精性肝氧化应激和肝脂肪变性。DAI 等[33]研究表明，竹节参皂苷可通过NF-κB/MAPK 信号通路来抑制脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞的炎症反应，是预防ALI 的一种很有潜力的天然药物。吴震英等[34]从细胞水平考察了铜死亡在脓毒症ALI 中的作用，发现小鼠发生脓毒症ALI 后，肝脏内铜死亡相关蛋白表达下降，即铜死亡参与了脓毒症导致的ALI。徐瑞等[35]研究表明，PSPJ 可能通过抗氧化和抗炎途径来减缓乙酰氨基酚（APAP）诱导的ALI。

3 结论

本研究探讨了PSPJ 通过PI3K/AKT/NF-κB 信号通路对ALI 大鼠的影响。由H&E 染色可知，模型组大鼠肝小叶中心坏死，肝脏细胞呈现空泡样改变，炎症细胞浸润，肝细胞素消失细胞凋亡。用药组肝脏病理变化显示，肝细胞炎性浸润明显减少，肝细胞坏死程度较模型组减轻；通过观测大鼠的一般情况和体质量，发现模型组大鼠由于体内炎症及的不断增多，体质量大体上持续上升（P<0.05）；PSPJ中、高剂量组及 LBSZ 组大鼠体质量先增加（P<0.05），后又恢复正常（P<0.05）。免疫组化检测结果表明，用药组阳性表达明显减少（P<0.05）；Western blot 检测表明，与空白对照组相比，模型组大鼠肝组织p-PI3K 蛋白表达显著下降（P<0.01），PI3K、p-AKT、p-NF-κB、IL-1β 蛋白表达显著升高（P<0.05）；与模型组相比，用药组p-PI3K 蛋白表达显著上升（P<0.05），p-AKT、IL-1β 蛋白表达显著下降（分别为P<0.01、P<0.05），表明PSPJ 可有效抑制ALI PI3K/AKT/NF-κB 信号通路的激活。

综合结果表明，PSPJ 可减轻炎性细胞因子和凋亡蛋白表达，从而对ALI 大鼠产生保护作用，其作用可能与抑制PI3K/AKT/NF-κB 通路活化有关：通过增强氧化应激水平，降低p-AKT、IL-1β、NF-κB等炎症指标，从而发挥其抗炎、抗氧化的作用。然而，本研究仍存在一定的不足，缺少体外实验（如细胞水平）的机制研究，后期将以此为基础，继续深入系统的研究，为其临床上开发保肝药提供更多的实验和理论依据。

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