核桃蛋白-低聚半乳糖复合纳米颗粒的制备及其Pickering 乳液性质
《精细化工》
2024年 41卷
第7期
中图分类号：TS201.2
微信
QQ空间
微博
QQ
全文 图表 参考文献 作者 出版信息
摘要
以核桃蛋白（WalPI）和低聚半乳糖（GOS）为原料，采用pH 循环-超声联合制备了WalPI-GOS，将其与茶油混合，制备了Pickering 乳液。通过FTIR、纳米粒度及Zeta 电位仪、紫外-可见分光光度计、荧光分光光度计、DSC 对WalPI-GOS 进行了表征，考察了m(WalPI)∶m(GOS)对WalPI-GOS 颗粒特性及Pickering 乳液性质的影响。结果表明，当m(WalPI)∶m(GOS)＝10∶4 时，WalPI-GOS 和Pickering 乳液具有最佳的性能。WalPI-GOS的平均粒径为82.08 nm，Zeta 电位为-52.37 mV，乳化活性、乳化稳定性为31.12 m/g 和4346.35 min；WalPI 部分疏水基团被包埋于WalPI-GOS 分子内部，降低了表面疏水性（840.81 a.u.），提高了游离巯基含量（8.78 μmol/g）和熔融温度（93.74 ℃）；WalPI 与GOS 的复合改变了WalPI 的二级和三级结构，形成以β-折叠为主的二级结构，WalPI 与GOS 通过氢键、静电相互作用和疏水相互作用形成紧密的网络结构；Pickering 乳液平均粒径仅为5.24 μm，液滴均匀分布，形成了弹性凝胶网络结构；当剪切速率为0.1 s 时，具有最高的表观黏度（1.06 Pa·s）。WalPI 与GOS 间的高交联密度增强了Pickering 乳液的凝胶网络结构。
关键词: 核桃蛋白 低聚半乳糖 复合纳米颗粒 Pickering 乳液 稳定性 食品用化学品
蛋白质具有两亲性、构象可调节性、生物相容性和可降解性等特点，是潜在的食品级乳化剂。核桃粕为核桃加工副产物，蛋白质含量高于50%，但其综合利用率较低，导致了蛋白资源的浪费 。研究 表明，pH 循环-超声联合制备的核桃蛋白纳米颗粒可作为乳化剂稳定Pickering 乳液，由于超声的空化效应和机械剪切可促进蛋白质结构展开，削弱蛋白质分子间的非共价相互作用，促进其与多糖相互作用，强烈的空化效应还可以使蛋白质断裂，减小其粒径。与单一pH 循环相比，pH 循环-超声联合制备的蛋白纳米颗粒粒径更小、溶解性和表面疏水性更高 。但以此制备的Pickering 乳液在中性条件下稳定性较差 。与多糖和蛋白质相比，蛋白质-多糖复合颗粒具有良好的乳化性和较强的空间稳定性，是制备Pickering 乳液的理想乳化剂。蛋白质-多糖复合颗粒吸附于油-水界面时，分散液滴周围形成黏弹性薄膜，可提高乳液抵抗机械应力的能力和空间稳定性 。YILDIZ 等 采用pH 循环-超声联合制备大豆分离蛋白（SPI）-淀粉复合颗粒时发现，SPI 的乳化性和溶解性（等电点附近溶解性良好）得到提高，复合颗粒乳液稳定，油脂氧化程度低。
低聚半乳糖（GOS）作为功能性寡糖，不被人体消化吸收，可促进肠道益生菌增殖代谢，具有调节脂质代谢、提高机体免疫力和促进钙吸收等作用 。研究 表明，通过湿法糖基化制备蛋白质-GOS 复合物可提高蛋白质的乳化性和稳定性，蛋白质与GOS发生共价交联形成致密有序的凝胶网络结构，增强了疏水相互作用和二硫键作用。赵晨宇等 通过湿法糖基化改性SPI 制备SPI-GOS，显著提高了SPI的溶解度与乳化性（ P ＜0.05），增强了乳液稳定性。但湿法糖基化改性蛋白质易受反应时间、温度及相对湿度等因素的影响，且其反应可控性差，极易发生Maillard 反应高级阶段，产生大量副产物，从而限制了其工业化应用 。目前，通过pH 循环-超声联合制备核桃蛋白-低聚半乳糖非共价复合纳米颗粒（WalPI-GOS），并以WalPI-GOS 为乳化剂制备Pickering 乳液的研究鲜有报道
本文拟以WalPI 和GOS 为原料，采用pH 循环-〔先将WalPI（pH 7.0）溶于水中调pH 至11.5 使其充分展开后，使用D-葡萄糖酸- δ -内酯（GDL）调pH 至7.0〕超声联合制备WalPI-GOS，研究WalPI和GOS 质量比对WalPI-GOS 粒径、Zeta 电位、乳化性和表面疏水性等的影响，揭示WalPI 和GOS 间相互作用力。同时，以WalPI-GOS 为乳化剂制备Pickering 乳液，探究 WalPI 和 GOS 质量比对Pickering 乳液性质的影响，以期为核桃蛋白和功能性食品的开发利用提供新思路及理论参考。
1 实验部分
1.1 材料与试剂
WalPI 固体颗粒，参照文献[2]方法自制（pH=7.0，其中蛋白质质量分数80.17%，灰分质量分数2.22%，水质量分数7.83%，脂肪质量分数0.87%）；茶油，益海嘉里食品营销有限公司；GDL、2-硝基苯甲酸（DNTB）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na），上海麦克林生化科技股份有限公司；十二烷基磺酸钠（SDS），天津市风船化学试剂科技有限公司；8-苯氨基-1-萘磺酸盐（ANS）、GOS，上海源叶生物科技有限公司；所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
Nano-ZS 型纳米粒度及 Zeta 电位仪，英国Malvern 公司；UV-2600 型紫外-可见分光光度计、IR Prestige-21 型傅里叶变换红外光谱仪、RF-5301PC 型荧光分光光度计，日本Shimadzu 公司；FJ200-SH 型数显高速分散均质机，上海沪析实业有限公司；LA-960V2 型激光粒度仪，日本Horiba 公司；HR 20 Discovery 型混合型流变仪，美国TA Instruments 公司；3500 Sirius 型差示扫描量热仪，德国Netzsch 公司；SK2009 光学显微镜，深圳赛克电子科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 WalPI-GOS 的制备
基于本课题组方法 制备WalPI-GOS：分别制备质量浓度20 g/L 的WalPI 水溶液（用1 mol/L 的NaOH 溶液调pH 至11.5）和质量浓度2、4、6、8、10 g/L 的 GOS 水溶液，各自在室温搅拌 4 h（200 r/min）；将WalPI 水溶液与GOS 水溶液等体积混合，保持WalPI 质量浓度恒定为10 g/L，调节 m (WalPI)∶ m (GOS)为10∶0、10∶1、10∶2、10∶3、10∶4 和10∶5。用浓度1 mol/L 的NaOH 水溶液调混合液pH 至11.5，室温搅拌3 h 后，冰浴超声（570 W，25 kHz）破碎5 min，静置1 h；用质量分数10%的GDL 溶液调pH 至7.0，12000 r/min 离心15 min，上清液透析（截留相对分子质量为3500）48 h，取袋内物冷冻干燥（-60 ℃，0.06 MPa）24 h，即得不同 m (WalPI)∶ m (GOS)的WalPI- GOS。
1.3.2 Pickering 乳液的制备
将一定量冻干的WalPI-GOS 颗粒加入8.0 mL去离子水中于12000 r/min 高速分散2 min 后得到质量浓度为20 g/L 的WalPI-GOS 样品溶液，缓慢加入12 mL 茶油，于12000 r/min 分散3 min 后，冰浴超声（475 W，25 kHz）破碎4 min，得Pickering 乳液 。
1.4 W alPI-GOS 性质测定
1.4.1 粒径、多分散系数和Zeta 电位测定
用纳米粒度及Zeta 电位仪测定WalPI-GOS 的粒径、多分散系数（PDI）和Zeta 电位，测试温度25 ℃。
1.4.2 乳化活性与乳化稳定性测定
取100 μL 新鲜Pickering 乳液，用质量分数0.1%的SDS 溶液稀释至300 倍，以质量分数0.1%的SDS溶液为空白，测定稀释后的Pickering 乳液在500 nm处的吸光度（ A 0 ），静置30 min 后再次测其吸光度（ A 30 ）。根据公式（1）和（2）计算乳化活性（EAI，m 2 /g）与乳化稳定性（ESI，min） 。
式中： N 为Pickering 乳液的稀释倍数，300； ρ 为蛋白质质量浓度，0.02 g/mL； φ 为油相体积分数，60%； L 为比色皿光程，1 cm； A 0 和 A 30 为放置0、30 min后的吸光度。
1.4.3 表面疏水性测定
参照ZHANG 等 方法，略作修改。将一定量冻干的WalPI-GOS 颗粒加入到浓度为0.01 mol/L 的磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH=7.0）中得到质量浓度分别为0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 和0.5 g/L的WalPI-GOS 样液。取2.0 mL 样液，加入40 μL的ANS 溶液（8 mol/L）混匀，静置15 min。用荧光分光光度计在390 nm 激发波长和470 nm 发射波长下测定溶液的荧光强度，狭缝5 nm。以蛋白质质量浓度和荧光强度为横、纵坐标作图，其初始斜率为表面疏水性（ H 0 ）。
1.4.4 游离巯基含量测定
参照ZHANG 等 方法，略作修改。将一定量冻干的WalPI-GOS 颗粒加入20 mL 浓度为0.1 mol/L的PBS（pH 为8.0，含1.0 mmol/L EDTA-2Na 和质量分数1.0%的SDS）中配成蛋白质量浓度为3.75 g/L的WalPI-GOS 溶液，于4000 r/min 离心15 min。取1.5 mL 上清液，加入1.5 mL 的PBS（0.1 mol/L，pH为8.0）和0.05 mL DNTB 溶液〔396 mg DTNB 溶于0.1 mol/L PBS（pH 为8.0）定容至100 mL〕混匀，涡旋1 h 后，4000 r/min 离心15 min，取上清液于412 nm 处测定其吸光度，以蒸馏水代替DNTB 为空白。按公式（3）计算样品中游离巯基含量（ μmol/g）。
式中： ρ 为蛋白质量浓度，g/L； ε 为Ellman 的消光系数，13600 L/(mol·cm)； A 412 为上清液于412 nm 处测定的吸光度； L 为光程，1 cm； D 为稀释倍数，2.03。
1.4.5 热稳定性测定
采用差示扫描量热仪（DSC）分析WalPI-GOS的热稳定性。取2.5 mg 的WalPI-GOS 于坩埚中，空坩埚为对照，测试温度30～180 ℃，升温速率10 ℃/min，氮气流速为20 mL/min。
1.4.6 内源荧光光谱测定
参照ZHANG 等 方法并稍作修改。取样品溶液进行荧光光谱扫描，WalPI-GOS 质量浓度为0.02 g/L（溶于0.01 mol/L PBS，pH 为7.0）。发射波长300～500 nm，激发波长285 nm。
1.4.7 FTIR 测定
用FTIR 测定WalPI-GOS 的结构，波数范围4000～400 cm -1 ，扫描32 次，分辨率为4 cm -1 。
1.5 Pickering 乳液性质测定
1.5.1 乳液粒径
用激光粒度仪测定Pickering 乳液的平均粒径与粒径分布，测试温度25 ℃。
1.5.2 显微结构
采用光学显微镜观察Pickering 乳液形态，于1000 倍下观察并拍照保存。
1.5.3 流变特性
在温度25 ℃、剪切速率0.1～1000 s -1 的条件下，用混合型流变仪测定Pickering 乳液的表观黏度；振荡频率0.01～100 Hz，记录乳液的储能模量（ G ′）和损耗模量（ G ″）。
1.6 数据处理与分析
采用SPSS 22.0 软件处理分析数据，文中所有图的不同小写字母表示数据差异显著（ P ＜0.05），Origin 9.0 软件绘图，图表中数据为3 次实验平均值。
2 结果与讨论
2.1 W alPI-GOS 颗粒特性
2.1.1 粒径和Zeta 电位
图1 为 m (WalPI)∶ m (GOS)对WalPI-GOS 平均粒径、PDI 和Zeta 电位的影响。
图1 WalPI 和GOS 质量比对WalPI-GOS 平均粒径、PDI（A）和Zeta 电位（B）的影响
从 图1 A 可以看出，随着 m (WalPI)∶ m (GOS)从10∶0 变化至10∶5，WalPI-GOS 平均粒径先减小后增大，PDI 总体上减小。当 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶4 时， WalPI-GOS 平均粒径为82.08 nm（ P ＜0.05），PDI 为0.34，表明WalPI-GOS 粒径分布范围较窄，粒径最小。由于GOS 与WalPI 通过氢键和疏水相互作用紧密结合，WalPI-GOS 平均粒径要比纯WalPI〔 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶0〕减小 [13-14] ，同时GOS添加量增加，WalPI-GOS 分子间静电斥力增强，其聚集程度降低，表现为PDI 的降低。但随着GOS添加量继续增加〔 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶5〕，WalPI-GOS 平均粒径显著增至145.03 nm（ P ＜0.05），原因为大分子的空间位阻造成多糖与蛋白质结合位点较少 ，多余GOS 包覆至WalPI 表面，导致WalPI-GOS 结构松散，颗粒间发生黏连，粒径增大。李娜等 也发现类似结果。
从 图1 B 可以看出，除GOS（-5.96 mV）外，所有样品Zeta 电位绝对值均大于30 mV，具有良好的稳定性。随着 m (WalPI)∶ m (GOS)从10∶0 变化至10∶5，WalPI-GOS 的Zeta 电位绝对值先增大后减小，当 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶4 时，Zeta 电位为-52.37 mV。Zeta 电位可反映颗粒的稳定性，其绝对值越大颗粒稳定性越高，同时反映颗粒间的相互作用 。上述结果表明，GOS 添加量的增加增强了WalPI-GOS 间的静电斥力和体系稳定性，与粒径结果一致。XU 等 研究表明，带相同静电荷的生物聚合物可通过表面选择性贴片结合产生静电相互作用。所以，在WalPI 与GOS 复合过程中，两者间产生静电相互作用，使WalPI-GOS 的Zeta 电位绝对值增大。此外，在碱性和超声条件下，WalPI 与GOS复合，改变了WalPI 的构象，部分极性基团暴露，增加了极性基团电离过程中分子表面净负电荷和带电残基数量 [18-19] 。
2.1.2 EAI 与ESI 分析
图2 为 m (WalPI)∶ m (GOS)对WalPI-GOS 的EAI和ESI 的影响。
图2 WalPI 和GOS 质量比对WalPI-GOS 的EAI 和ESI的影响
蛋白质-多糖复合物的乳化能力与其复合状态有关，其协同吸附可提高蛋白质的乳化能力，并在油相表面形成弹性膜，增强乳液稳定性 [4,20] 。从 图2 可以看出，随着 m (WalPI)∶ m (GOS)从10∶0 变化至10∶5，WalPI-GOS 的EAI 和ESI 均先增大后减小，但当 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶5 时，WalPI-GOS 的EAI 和ESI 还是均显著高于10∶0 时的值（ P ＜0.05）。这是因为，亲水性羟基的引入改善了WalPI 的亲水亲油平衡。当 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶4 时，WalPIGOS 的EAI 和ESI 分别为31.12 m 2 /g 和4346.35 min（ P ＜0.05）。由于GOS 的亲水基团吸附于WalPI 分子内，二者通过疏水相互作用结合，WalPI 疏水区域被包埋 ，其对油-水和气-液界面的吸附率增加。此外，当 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶4 时，更多的GOS糖基链接枝至WalPI 内，WalPI-GOS 结构增强，可紧密吸附于油水界面。而 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶5时WalPI-GOS 的EAI 和ESI 降低，由于过量多糖使乳液体系黏性增加，液滴再分散性降低 。
2.1.3 表面疏水性分析
表面疏水性由蛋白质表面与水环境接触的疏水基团数量决定，其大小与蛋白质结构和乳化特性有关 。 图3 为 m (WalPI)∶ m (GOS)对WalPI-GOS 的表面疏水性的影响。
图3 WalPI 和GOS 质量比对WalPI-GOS 表面疏水性的影响
从 图3 可以看出，随着 m (WalPI)∶ m (GOS)从10∶0 变化至10∶5，WalPI-GOS 的表面疏水性先减小后增大，当 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶4 时，表面疏水性最小，仅为840.81 a.u.。这是因为，一方面，GOS 与WalPI 相互作用导致WalPI-GOS 结构紧缩，将疏水基团包埋于WalPI-GOS 内部，pH 由11.5 降至7.0 时，WalPI 与GOS 共同折叠，将部分疏水氨基酸包埋于复合体系中，WalPI 与GOS 分子间发生疏水相互作用 [24-25] ；另一方面，多糖可增强蛋白质表面的空间位阻，将更多表面疏水基团包埋于分子内部，降低表面疏水性 。丛海花等 发现，与酶解褐藻寡糖复合后，鲢肌原纤维蛋白表面疏水性降低，与本文研究结果一致。
2.1.4 游离巯基含量分析
图4 为 m (WalPI)∶ m (GOS)对WalPI-GOS 的游离巯基的影响。
图4 WalPI 和GOS 质量比对WalPI-GOS 游离巯基含量的影响
从 图4 可以看出，当 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶0时，WalPI-GOS 游离巯基含量为1.83 μmol/g；当 m (WalPI)∶ m (GOS)为10∶4 时，其游离巯基含量显著增至 8.78 μmol/g（ P ＜0.05）；而当 m (WalPI)∶ m (GOS)为10∶5 时，其游离巯基含量增加不显著（ P ＞0.05）。这是因为，一方面，碱性和超声条件下，蛋白质内部二硫键断裂，肽链伸展，其分子内部巯基暴露；另一方面，适量多糖可促进蛋白质结构展开，暴露更多巯基，而过量添加多糖，可导致蛋白质与多糖间发生相分离，促进蛋白质分子间相互交联、聚集，部分巯基被包埋于分子内部 ，所以，其含量变化不显著（ P ＞0.05）。徐永霞等 探究酵母 β -葡聚糖添加量对肌球蛋白巯基含量的影响时发现类似结果。
2.1.5 热稳定性分析
DSC 曲线可反映蛋白质-蛋白质、蛋白质-多糖间的相互作用 。 图5 是不同 m (WalPI)∶ m (GOS)的WalPI-GOS 的DSC 曲线。
图5 WalPI-GOS 的DSC 曲线
从 图5 可以看出，当 m (WalPI)∶ m (GOS)在10∶0～10∶5 变化时，WalPI-GOS 的熔融温度分别为76.65、91.70、90.70、92.76、93.74 和89.72 ℃，表明WalPI 与GOS 相互作用形成了稳定的网络结构，提高了WalPI-GOS 的热稳定性。原因在于，WalPI与GOS 结合产生的空间位阻限制了分子链运动 ，体系的交联密度增强；此外，WalPI 与GOS 间的氢键作用也限制了蛋白质链的节段迁移率 ，进一步增强了 WalPI-GOS 的热稳定性。与 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶0 相比，当 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶4时，WalPI-GOS 熔融温度由76.65 ℃增至93.74 ℃，提高了17.09 ℃。原因在于，GOS 与WalPI 通过氢键、静电相互作用和疏水相互作用形成稳定的网络结构，GOS 用量增加会导致此网络结构更加紧密，进而增强WalPI-GOS 热稳定性。DAI 等 发现，卵磷脂、玉米醇溶蛋白和姜黄素间的疏水和静电相互作用可提高复合颗粒的热稳定性。而当 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶5 时，WalPI-GOS 熔融温度降低。原因在于，GOS 添加量过多发生团聚，因而无法均匀分布于蛋白质表面，减弱了WalPI-GOS 的结构，进而降低其熔融温度。
2.1.6 内源荧光光谱分析
内源荧光光谱可反映蛋白质芳香族氨基酸残基微环境极性变化，是评价蛋白质三级结构变化的重要方法。 图6 是不同 m (WalPI)∶ m (GOS)的WalPIGOS 内源荧光光谱图。
图6 WalPI-GOS 的内源荧光光谱
从 图6 可看出，随着 m (WalPI)∶ m (GOS)从10∶0 变化至10∶5，WalPI-GOS 的荧光强度先下降后上升，最大发射波长不变（364 nm）。表明GOS 与WalPI形成非共价复合物，两者间存在疏水相互作用，改变了蛋白质三级结构，WalPI 重折叠速率降低，形成了刚性结构，导致荧光猝灭，这与2.1.4 节结果一致。当 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶4 时荧光强度最低，这是因为，WalPI 与GOS 复合为内源色氨酸残基提供了疏水环境 ，蛋白质分子内的荧光基团与多糖作用，荧光强度降低 [31-32] 。此外，多糖的羟基对荧光也产生屏蔽作用 。
2.1.7 FTIR 分析
图7 是不同 m (WalPI)∶ m (GOS)的WalPI-GOS的FTIR 谱图和二级结构。
图7 WalPI 和GOS 质量比对WalPI-GOS 的FTIR 谱图（A）和二级结构（B）的影响
从 图7 A 可以看出，WalPI-GOS 于 3000～3600 cm -1 处宽峰为 O—H 键伸缩振动，2926～2965 cm -1 处峰为C—H 键伸缩振动。1654、1546 和1241 cm -1 附近峰分别对应酰胺Ⅰ带C==O 键伸缩振动、酰胺Ⅱ带C—N 键的伸缩和N—H 键的弯曲振动、酰胺Ⅲ带甘氨酸和脯氨酸的—CH 2 键的弯曲振动 。与 m (WalPI)∶ m (GOS)=10 ∶0 相比， m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶1～10∶5 的3404 cm -1 峰发生偏移（3377～3300 cm -1 ），酰胺Ⅰ（1654～1646 cm -1 ）和酰胺Ⅱ带（1546～1539 cm -1 ）峰发生轻微偏移。表明WalPI 中谷氨酰胺的酰胺基与GOS 的羟基发生作用形成氢键，两者发生静电和疏水相互作用 [14,35] 。LIU 等 也发现类似结果。此外，1401、1150、1066(1040) cm -1 处峰与—OH 的弯曲振动、吡喃糖环C—O 吸收峰、C—O 键伸缩振动有关 。当 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶1～10∶5 时，WalPI-GOS具有WalPI 和GOS 的特征峰，表明WalPI 与GOS间产生相互作用，GOS 参与复合纳米颗粒的形成，改变了WalPI 的结构。综上，WalPI 与GOS 通过氢键、疏水相互作用和静电相互作用非共价络合。
从 图7 B 可以看出，随着 m (WalPI)∶ m (GOS)从10∶0 变化至10∶4，蛋白质 α -螺旋和 β -转角相对含量降低，而 β -折叠和无规则卷曲相对含量增加，形成以 β -折叠为主的二级结构， β -折叠相对含量增加有助于形成更有序的网络结构 。这表明，GOS可促进 α -螺旋和 β -转角向 β -折叠和无规则卷曲转变，改变WalPI 的二级结构和空间构象，氢键参与了WalPI-GOS 的形成。原因在于，GOS 可促进蛋白质 α -螺旋结构展开，诱导蛋白质的去折叠反应，蛋白质内部氢键相互作用降低，部分活性基团（疏水基团和活性巯基）暴露 [38-39] ，使其与GOS 结合形成致密的三维网状结构。栗俊广等 也发现类似结果。
2.2 Pickering 乳液性质
2.2.1 乳液粒径与微观形态
图8 为Pickering 乳液平均粒径和粒径分布图。
图8 WalPI 和GOS 质量比对Pickering 乳液的平均粒径（A）和粒径分布（B）的影响
从 图8 可以看出，随着 m (WalPI)∶ m (GOS)从10∶0 变化至10∶5，Pickering 乳液平均粒径先减小后增大（ 图8 A），粒径分布均呈单分散体系（ 图8 B）。相较于 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶0，当 m (WalPI)∶ m (GOS)=10 ∶4 时，Pickering 乳液平均粒径从6.42 μm 降低至5.24 μm，降幅18.38%，粒径分布范围窄，峰值高。原因在于，一方面，固体颗粒粒径小可提高其油水界面吸附率，乳液粒径降低，表明液滴表面静电荷增加，液滴间静电斥力增强，其分散越均匀，稳定性越高 [40-41] ；另一方面，WalPI-GOS不可逆地紧密吸附于油水界面，界面膜有效阻碍了液滴间的碰撞和絮凝 。当 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶5 时，乳液平均粒径显著增至7.23 μm（ P ＜0.05），粒径分布范围宽，峰值低。这是因为，GOS 添加量超过临界值，过量GOS 自身或与蛋白质分子间结合形成络合物引起液滴絮凝，导致乳液粒径增大，稳定性降低；此外，乳液粒径大小是液滴破裂和再聚集间平衡的结果，大固体颗粒吸附能力较差，促进液滴的重新聚集，导致乳液粒径增大 。此结果与2.1.1节结果一致。
图9 为 m (WalPI)∶ m (GOS)对Pickering 乳液微观结构的影响。
图9 WalPI 和GOS 质量比对Pickering 乳液微观结构的影响
从 图9 可以看出，Pickering 乳液均呈圆球状、结构完整。当 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶4 时，乳液液滴分布均匀，粒径最小。这是因为，液滴间的静电斥力和糖链的空间位阻效应阻碍了液滴聚集 ，WalPI-GOS 在油-水界面形成牢固且有序的界面层，阻碍液滴发生团聚和奥斯特瓦尔熟化（Ostwald Ripening），提高了 Pickering 乳液的稳定性。当 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶5 时，乳液液滴分布变得不均匀，粒径增大。原因可能在于，多余的GOS 与WalPI-GOS 竞争吸附于油-水界面，部分WalPI-GOS被GOS 替代，导致界面蛋白含量减少，界面张力增强，界面膜无法包裹油相，乳液粒径增大，稳定性降低。此结果与乳液粒径结果一致。
2.2.2 乳液流变特性
图10 为 m (WalPI)∶ m (GOS)对Pickering 乳液流变特性的影响。
图10 WalPI 和GOS 质量比对Pickering 乳液表观黏度（A）、
从 图10 A 可以看出，当 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶0 时，在剪切速率为0.1～25 s -1 的区间，Pickering乳液表观黏度随剪切速率增大而减小，呈剪切稀化特性，属假塑性流体；而在剪切速率25～1000 s -1 的区间，Pickering 乳液表观黏度基本保持不变，呈牛顿流体特性。这是由于剪切速率增大，乳液内部网络结构被破坏，液滴发生形变并沿流线方向有序排列，其流动阻力降低 。当 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶1～10∶5 变化时，在剪切速率为0.1～600 s -1 的区间，Pickering 乳液呈剪切稀化特性；在剪切速率为600～1000 s -1 的区间，乳液呈牛顿流体特性。表明 m (WalPI)∶ m (GOS)的变化未改变Pickering 乳液的牛顿流体特性。当剪切速率为0.1 s -1 时，Pickering乳液表观黏度随 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶0～10∶5变化呈先增大后减小的趋势，当 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶4 时乳液表观黏度最大，为1.06 Pa·s。表明GOS 用量的增加，可增强液滴间的相互联结，形成致密的三维网状结构。因WalPI-GOS 紧密排列于油水界面，乳液粒径和界面张力减小 ，Pickering乳液表观黏度增大，液滴迁移率降低。GOS 用量增加，在连续相中形成紧密堆积的界面层和三维网状结构 ，提高了WalPI-GOS 的力学性能，形成稳定有序的网络结构。当 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶5 时Pickering 乳液表观黏度降低，原因为多余的GOS与WalPI-GOS 竞争吸附于油水界面，加剧了乳滴间的布朗运动，导致乳液发生聚集或絮凝。但因WalPI-GOS 间的静电作用，游离的GOS 可作为填充剂填充于连续相中提高Pickering 乳液表观黏度，因此， m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶5 时的Pickering 乳液表观黏度大于 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶0 时的。
乳液动态模量通过 G ′和 G ″表示， G ′和 G ″分别反映乳液的弹性（凝胶）和黏性（流体）性质 。从 图10 B 可以看出，频率0.01～100 Hz 下，所有Pickering 乳液〔除 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶0 之外〕 G ′均高于 G ″，表明形成了弹性为主的凝胶网络结构。在频率为1×10 -4 ～10 Hz 范围内， m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶0 的Pickering 乳液呈弱凝胶网络结构（ G ′＞ G ″），继续增加频率（＞10 Hz），其凝胶网络结构被破坏（ G ′＜ G ″）。表明增加 GOS 用量可增强Pickering 乳液的凝胶网络结构，这是因为，GOS 在凝胶网络中起到“活性填料”的作用 ，GOS 作为多糖具有增稠和填充作用，可在水相中形成网络结构，通过空间位阻限制油滴的流动，增强乳液的凝胶网络结构 。此外，WalPI 与GOS 间的高交联密度有助于增强Pickering 乳液的凝胶网络结构。
3 结论
以WalPI 和GOS 为原料，采用pH 循环-超声联合制备 WalPI-GOS，并将其与茶油混合，制备了Pickering 乳液。探究 m (WalPI)∶ m (GOS)在 10∶0～10∶5 变化对WalPI-GOS 颗粒特性及Pickering 乳液性质的影响。
（1）与 m (WalPI)∶ m (GOS)=10 ∶0 相比， m (WalPI)∶ m (GOS)在10∶1～10∶5 时，WalPI-GOS及其Pickering 乳液综合性能更佳。
（2）当 m (WalPI)∶ m (GOS)＝10 ∶4 时，WalPI-GOS 的平均粒径、Zeta 电位分别为82.08 nm和-52.37 mV，表现出良好的稳定性；EAI、ESI 为31.12 m 2 /g、4346.35 min，展现了良好的乳化性；WalPI 部分疏水基团被包埋于WalPI-GOS分子内部，表面疏水性降至 840.81 a.u.，而其游离巯基含量（8.78 μmol/g）和熔融温度（93.74 ℃）增加；WalPI与GOS 的复合改变了WalPI 的二级和三级结构，形成以 β -折叠为主的二级结构，WalPI 与GOS 通过氢键、静电相互作用和疏水相互作用形成紧密的网络结构。
（3）当 m (WalPI)∶ m (GOS)=10∶4 时，Pickering乳液平均粒径仅为5.24 μm，液滴均匀分布，形成了弹性凝胶网络结构；当剪切速率为0.1 s -1 时，具有最高的表观黏度（1.06 Pa·s）；WalPI 与GOS 间的高交联密度增强了Pickering 乳液的凝胶网络结构。
