Page 102 - 《精细化工》2023年第1期
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·94·                              精细化工   FINE CHEMICALS                                 第 40 卷

                                                        [1]
            滞、价格昂贵等弊端直接导致了高品质 EPA 的短缺 。                        1   实验部分
            因此，亟待开发可持续性 EPA 生产替代品。微藻因
            生长周期短、环境适应性强、光合固碳效率高、不                             1.1   材料、试剂与仪器
            与粮食和农用耕地竞争等优势成为开发 EPA 的新资                              三角褐指藻，湘潭大学化工学院藻菌功能因子
            源。但通过激素、高光、营养、高盐、培养模式等                      [1-8]  开发利用实验室保存菌株；富里酸（质量分数>
            环境因子诱导的微藻 EPA 产量与工业化应用相比尚                          85%），上海麦克林生化科技有限公司；十九烷酸（质
            存在差距。                                              量分数>99%）、二十碳五烯酸甲酯（质量分数>
                 通过调控 EPA 合成积累相关的脂肪酶（如                         97%），美国 Sigma 公司；ELISA 检测试剂盒、总抗
            CrDGTT1、Δ0-ELO1、NoDGAT2K 和转酰酶            [9-11] ）、  氧化能力检测试剂盒，上海酶联生物科技有限公司；
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            延长酶、去饱和酶（如 Δ 去饱和酶                [12] ）以及 EPA      比色定量试剂盒，南京建成生物工程研究所；活性
            合成基因簇      [13] 等可有效提高微藻 EPA 产率         [14] 。然    氧检测试剂盒，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
            而，通过转基因策略提高 EPA 产率会因转基因藻株                          磷酸二氢钠、硅酸钠、氯化铁、乙二胺四乙酸二钠、
            商业化存在的环境风险与危害以及高额费用面临巨                             硫酸铜、钼酸钠、硫酸锌、氯化钴、氯化锰，分析
            大挑战。另外，微藻 EPA 在合成积累过程中常伴随                          纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；甘油，分析
            活性氧含量增加现象，易引发 EPA 合成不稳定和氧                          纯，湖南汇虹试剂有限公司；海盐，青岛海之盐水
            化分解，最终导致 EPA 产率下降             [15] 。近年来，众多         族科技有限公司。
            研究者尝试通过外源补充特定抗氧化剂〔如，抗坏                                 SCIENTZ-18N 型冷冻干燥机，宁波新芝生物科
            血酸  [15] 、芝麻酚  [16] 、富里酸（FA）   [17-18] 、褪黑素 [19] 〕  技股份有限公司；DHZ-DA 型全温大容量摇床，苏
            防止脂质过氧化策略来提高多不饱和脂肪酸产率。                             州培英实验设备有限公司；H-1850 型医用离心机，
            近期在裂壶藻中过表达超氧化物歧化酶（SOD）发                            湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；DZF-6050  型
            现，其氧化应激增强的同时多不饱和脂肪酸（PUFA）                          真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；GC-7900
            含量获得显著提高         [20] 。实际上，这些抗氧化剂调控                型气相色谱仪，上海天美科学仪器有限公司；F50
            EPA 生物合成效果类似于基因过度表达和干扰策                            型全自动酶标仪，瑞士 Sunrise 公司。
            略，包括改善前体供应和阻断竞争途径等，并且生                             1.2   富里酸诱导培养三角褐指藻
            成的脂质可被这些化学物质保护而不被氧化，大大促                                人工海水培养基的配制∶每升蒸馏水中加入 20 g
            进了微藻细胞生长和多不饱和脂肪酸积累                   [15,21] ，因而   海盐、9.2 g 甘油、10 mg 磷酸二氢钠、30 mg 硅酸
            是一类有效改善微藻大规模培养，积累多不饱和脂                             钠、3.15 mg 氯化铁、4.36 mg  乙二胺四乙酸二钠、
            肪酸的理想策略。                                           9.80  μg 硫酸铜、6.30  μg  钼酸钠、22  μg  硫酸锌、
                 三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）胞内            10 μg  氯化钴、180 μg 氯化锰。
            富含 EPA、少二十二碳六烯酸（DHA）、无叶绿素，                             挑取三角褐指藻单菌落接入 100 mL 改良 f/2 人
            因而后续可简化 EPA 分离操作、降低提纯成本以及                          工海水培养基（在人工海水培养基基础上添加 1.17 g
            获得高质量藻油，并且具备完整的 EPA 合成酶系以                          胰蛋白胨和 0.3 g 尿素，pH=8.0），在（20±1）℃、
            及全基因组序列，是研究 EPA 合成积累的生物模式                          光照强度（2000±100）lux、转速 120 r/min 下培养
            藻株。富里酸作为含芳香环和酚羟基、酮羰基、醌羰                            192 h 获得三角褐指藻种子液。无菌操作下将 10 mL
            基、羧基、烷氧基且对超氧化物和羟基自由基有较强                            三角褐指藻种子液接入含不同质量浓度富里酸（0、
            清除活性的天然抗氧化剂，已被证实可有效促进微藻                            20、40、60、80、100 mg/L）的 100 mL 改良 f/2 人
            色素生物合成       [22] 、重金属吸收解毒     [23] ，并可通过调节        工海水培养基中，在（20±1）℃、暖白光全光照
            营养物质吸收和光合作用方式控制单针藻、裂壶藻、雨                           （2000±100）lux、转速 120 r/min 下培养 240 h 获得
            生红球藻等生长、抗氧化水平以及脂质积累                  [17-18,21,24-25] 。  不同浓度富里酸诱导的三角褐指藻藻液。以同样温
            然而，鲜见通过富里酸诱导三角褐指藻富集 EPA 的                          度、转速和光强条件下无富里酸诱导培养的三角褐
            报道。本研究通过外源添加不同浓度富里酸抗氧化                             指藻细胞作为对照。
            剂作用三角褐指藻，考察其对三角褐指藻细胞生物                             1.3   生物指标测定
            量和 EPA 产量的影响；综合三角褐指藻抗氧化酶、                          1.3.1   生物量测定
            抗氧化物质、抗氧化能力以及 EPA 合成通路关键酶                              收集不同浓度富里酸处理以及无富里酸处理下
            活，解析富里酸抗氧化剂调控 EPA 合成累积机制，                          的三角褐指藻液，在 6000 r/min 下离心 20 min，弃
            为工业规模化应用抗氧化剂促微藻 EPA 积累提供理                          上清液收集藻泥，用蒸馏水洗涤藻泥 3~5 次，放置
            论参考。                                               在–80  ℃下预冻 12 h，然后在–58  ℃冷冻干燥至样
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