Page 104 - 《精细化工》2023年第1期
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·96·                              精细化工   FINE CHEMICALS                                 第 40 卷

                 收集不同浓度富里酸处理以及无富里酸处理下                          提高至总脂肪酸含量的 51%，而 EPA 含量较无 BHT
            的三角褐指藻液，在 6000 r/min 下离心 20 min，弃                  诱导组增加 10%。REN 等        [15] 和 SUN 等 [18] 发现，抗
            上清液收集藻泥，用蒸馏水洗涤藻泥 3~5 次，放置                          坏血酸和富里酸使得裂壶藻 DHA 含量分别达到细
            在–80  ℃下预冻 12 h，取低温冷冻藻泥样品 0.1 g，                   胞干重的 30.44%和 5.6%；而 LI 等       [31] 研究得出，褪
            加入 1 mL 总抗氧化能力检测试剂盒（T-AOC 分析                       黑素使得单针藻 EPA 含量由无褪黑素诱导下的细胞
            试剂盒）中的预冷提取液，超声破碎细胞释放胞内                             干重（0.17%）降至 0.079%；LIU 等       [16] 和 DIAO 等 [32]
            抗氧化物，4  ℃、8000 r/min  离心 5 min 获得上清                以芝麻酚诱导隐甲藻将隐甲藻 DHA 产量较无芝麻
            液粗提 取 物。将 200 µL 上清 液粗提 取 物 与                      酚诱导对照组分别提高了 20%和 0.025 mg/(L•d)。然
            0.2 mmol/L 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由                 而，不同抗氧化剂因作用藻株类型不同而诱导多不
            基混合，在 37  ℃下反应 30 min，在 517 nm 处测定                 饱和脂肪酸合成积累效率不同，即使不同抗氧化剂
            吸光度，细胞内总抗氧化能力（T-AOC）由式（5）                          诱导同种藻株或者同一抗氧化剂诱导不同类型藻
            计算得出（其中，CDW 为细胞干重）。                                株，甚至同一抗氧化剂诱导同种藻株也会因诱导方
                  T-AOC(U / mg CDW)   (A   1  A 2 ) /        式或作用模式不同而使藻株多不饱和脂肪酸产率大

                                       0.01 30 / m  CDW （5）    不相同。因此，本文考察了不同浓度富里酸对三角
                                                               褐指藻生物量及 EPA 产量的影响，结果见图 1。
            式中：A 1 为含 DPPH 溶液样品的吸光度；A 2 为不含

            DPPH 溶液对照样品的吸光度；m CDW 为细胞干重质量，g。
            1.3.6  EPA 合成去饱和酶和延长酶活测定
                 分别收集不同浓度富里酸处理以及无富里酸处
            理下的三角褐指藻新鲜藻液，取 20 mL 新鲜藻液，在
            4  ℃、8000 r/min 离心 5 min，弃上清液，再以 PBS
            缓冲液（pH 7.2）洗涤 3~5 次后加入 ELISA 检测试
            剂盒中提取液 200 µL，4  ℃、8000 r/min 离心 10 min，
            转移上清液至新离心管中，采用 ELISA 检测试剂盒
                                     6
                                                        12
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            测定 Δ -脂肪酸去饱和酶、Δ -脂肪酸去饱和酶、Δ -
                                                  17
                              15
            脂肪酸去饱和酶、Δ -脂肪酸去饱和酶、Δ -脂肪酸                          图 1   不同质量浓度富里酸对三角褐指藻生物量及 EPA
                         6
            去饱和酶和 Δ -脂肪酸延长酶活性。                                      产量的影响
                                                               Fig. 1    Effects of different mass concentrations of fulvic acid
            1.4   数据分析                                               on biomass and EPA productivity of P. tricornutum
                 实验数据采用平均值±标准差（n=3）表示，数
                                                                   由图 1 可知，随着富里酸浓度的增加，三角褐
            据分析采用 SPSS Statistics 26.0  软件进行，根据因素
                                                               指藻生物量呈先上升后下降的趋势，在富里酸质量
            方差分析（ANOVA）和  t  检验来确定各实验组之间差                      浓度为 0~20 mg/L 范围内，生物量由 3.01 g/L 提高
                              *
                                                **
            异，差异显著水平为（p<0.05）、极显著为 （p<0.01）。
                                                               至 3.27 g/L，在富里酸质量浓度为 60~80 mg/L 范围
            2   结果与讨论                                          内，生物量显著下降，甚至富里酸质量浓度为 80 mg/L
                                                               时获得的生物量（2.89 g/L）低于富里酸质量浓度为
            2.1   不同浓度富里酸对三角褐指藻生物量及 EPA                        0 的对照组（3.01 g/L）。而富里酸质量浓度为 40 mg/L
                 产量的影响                                         时诱导三角褐指藻生物量达到最大值，为 3.98 g/L，
                 已有报道证实，诸如褪黑素、丁基羟基甲苯                           较其他浓度富里酸诱导和对照组提高了 0.22~0.38
            （BHT）、叔丁基羟基茴香醚（BHA）、抗坏血酸等                          倍，这表明适宜浓度富里酸诱导对三角褐指藻生长
            抗氧化剂在促微藻生长和生物量积累方面功效显                              具有显著促进作用，而高浓度富里酸作用会对三角
            著 [28-29] 。其中，褪黑素处理使橡藻生物量提高至 4.11 g/L，             褐指藻生长产生抑制效应。这与 CHE 等                [17] 和 SUN
            而橡藻在富里酸（4.19 g/L）诱导下的生物量产率由                        等 [18] 报道的富里酸诱导对单针藻（Monoraphidium）
                                                       [28]
            无富里酸时的 445.56 mg/(L·d)  增至 513.79 mg/(L·d) ，       和裂壶藻（Schizochytrium）生长影响结果一致。由
            而且经褪黑素诱导处理单针藻生物量较无褪黑素处                             图 1 不同浓度富里酸诱导三角指藻 EPA 合成积累发
            理对照组提高 1.1 倍      [29] 。实际上，这些抗氧化化合物               现，随着富里酸浓度的增加，三角褐指藻 EPA 含量
            不仅能诱导微藻生物量积累，其与微藻多不饱和脂                             呈先增加后降低趋势。当富里酸质量浓度为 10 mg/L
            肪酸（如 DHA、EPA 等）合成积累效率也密切相关                 [21] 。  时，EPA 含量为 12.27 g/100 g，当富里酸质量浓度由
            SINGH 等  [30] 报道裂壶藻经 BHT 诱导后其 DHA 含量               40 mg/L 提高至 80 mg/L 时，EPA 含量显著下降，由
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