Page 103 - 《精细化工》2023年第1期
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第 1 期                    李玉芹，等:  富里酸诱导对三角褐指藻 EPA 合成积累的影响                                  ·95·


            品质量恒定，通过式（1）计算三角褐指藻生物量。                            测 765 nm 处吸光度。以没食子酸质量浓度为横坐标
                                BW  /V               （1）      （x），以吸光度为纵坐标（y），线性回归标准曲线
                                                                                   2
            式中：B 为生物量，g/L；V 为培养藻液体积，L；W                        为 y=0.5496x–0.0147(R =0.9986)。称取 1.3.1 节冻干
            为制得三角褐指藻干藻粉质量，g。                                   藻粉 50 mg，加入 2.5 mL 多酚提取液（蒸馏水 1 mL、
            1.3.2  EPA 含量和 EPA 产量测定                            0.2 mol/L 福林酚 1 mL、质量分数 20%碳酸钠水溶液
                 在 6000 r/min 条件下离心收集不同浓度富里酸                   500 µL），于 70 ℃水浴提取 30 min，2000 r/min 离
            处理以及无富里酸处理下的三角褐指藻液，弃上清                             心 10 min，取上清液，加入 0.2 mol/L 福林酚 1 mL
            液，收集藻泥并用蒸馏水洗涤藻泥 3~5 次，放置在                          混合反应 1 h，下检测 765 nm 处吸光度，根据标准曲
            –80  ℃下预冻 12 h，然后在–58  ℃冷冻干燥 48 h 获                线计算提取液多酚质量浓度（g/L）。按式（3）计算三
            得藻粉。准确称取 10 mg  冻干藻粉，加入 100  μL                    角褐指藻总多酚含量（mg/g）。
            十九烷酸-二氯甲烷内标液（1.0 g/L）和 2 mL KOH                          多酚含量以没食子酸计，      mg/g) 1000       VW （3）
                                                                          (
                                                                                                      /

            甲醇溶液（40 g/L），75  ℃水浴加热 15 min，冷却                   式中∶ρ 为提取液中多酚质量浓度，g/L；V 为提取
            至室温加入 2 mL BF 3 甲醇溶液〔V(BF 3)∶V(甲醇)=1∶              液体积，L；W 为三角褐指藻干藻粉质量，g。
            4〕，75  ℃水浴加热 15 min，待冷却至室温加入 1 mL                  1.3.5   总抗氧化能力测定
            饱和 NaCl 溶液和 2 mL 正己烷，在漩涡振荡器上涡                          丙二醛（MDA）水平可直接反应脂质氧化程度，
            旋 1 min 混匀，在 4000 r/min 下离心 8 min。取 1 mL           是用于衡量微藻细胞氧化胁迫的常用指标，因而需
            上清液过 0.22  μm 滤膜，在气相色谱仪（DB-23 高                    探究富里酸作用下三角褐指藻胞内 MDA 水平变化。
            效毛细管柱 30 mm×0.25 mm×0.25 μm，5975 内置探               收集不同浓度富里酸处理以及无富里酸处理下的三
            测器）上进行 EPA 含量测定。气相色谱仪载气为高                          角褐指藻液，在 6000 r/min 下离心 20 min，弃上清
            纯氮气，流速为 1 mL/min，样品不分流，进样量为                        液收集藻泥，用蒸馏水洗涤藻泥 3~5 次，放置在–80  ℃
            1 μL。程序升温条件：初始柱温 110  ℃保持 2 min，                   下预冻 12 h，取低温冷冻藻泥样品 0.1 g，加入体积
            以 5  ℃/ min 升高至 220  ℃保持 5 min。以国家标准               分数 10%的三氯乙酸水溶液 1 mL 冰浴匀浆，4  ℃
            GB 5009.168—2016 计算 EPA 含量（g/100 g），并以             离心 10 min 收集上清液，取 0.1 mL 上清液加入体
            式(2)计算 EPA 产量。                                     积分数 0.5%硫代巴比妥酸水溶液 0.3 mL 混匀，95  ℃
                                EPA含量
                      EPA产量               B   10 3  （2）     水浴 30 min，后离心取上清液 200 μL 于 96 孔板中，
                                   100                         测定 532 和 600 nm 处吸光度，记为 A 532 和 A 600 ，以
            式中∶EPA 产量，mg/L；EPA 含量，g/100 g；B 为
                                                               式（4）计算丙二醛（MDA）含量。
            生物量，g/L。
                                                                                                     9
                                                                  MDA含量   (nmol/g)  AV   / (   10 ) /
                                                                                                d
            1.3.3   抗氧化酶活测定                                                             反总
                                                                                   (wV   /V   )
                 收集富里酸处理以及无富里酸处理下的三角褐                                                   样   样  总        （4）
            指藻液 5 mL，在 8000 r/min 下 4  ℃离心 10 min，             式中：ΔA 为 532 nm 下吸光度值（A 532 ）与 600 nm
            弃上清液获得新鲜藻泥，以蒸馏水洗涤藻泥 3~5 次，                         下吸光度值（A 600 ）的差值；V 反总为反应体系总体积，
                                                                   –4
                                                                                                  3
            并将藻泥重悬于 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）                    4×10  L；ε为MDA摩尔消光系数，155×10  L/(mol·cm)；
            中，再以 6000 r/min 离心 2 min，弃上清液，取藻泥                  d 为 96 孔板直径，0.5 cm；V 样为样本体积，0.1 mL；
            沉淀进行液氮冻藏以备抗氧化酶活性测定。采用比                             V 样总为加入样品提取液体积，1 mL；w 为样本鲜重，g。
            色定量试剂盒测定三角褐指藻胞内过氧化物酶                                   分别收集不同浓度富里酸处理以及无富里酸处
            （POD）、SOD、过氧化氢酶（CAT）活性。                            理下的三角褐指藻新鲜藻液 5 mL，在 8000 r/min 下
            1.3.4   抗氧化物质含量测定                                  4  ℃离心 10 min，弃上清液获得藻细胞。根据 WANG
                 取 1.3.3 节获得的新鲜藻泥 0.1 g 于 10 mL 离心             等  [27]  报道的 2′,7′- 二 氯双氢荧光素二乙酸酯
            管中，并加入丙酮在漩涡振荡器上涡旋 1 min 混匀，                        （DCFH-DA）荧光探针法，取活性氧检测试剂盒中
            后持续在离心管中以质量分数 96%乙醇静止浸提 3 h                        1 mL 10 μmol/L DCFH-DA 加至藻细胞中，37  ℃避
            分层，直至下层浸提后藻泥残渣完全变白。离心取上层                           光下振荡反应 30 min，离心弃上清液，以 PBS（pH
            浸提液参照文献[26]报道方法测定总叶绿素含量。                           7.2）洗涤除去未反应 DCFH-DA，以荧光分光光度
                 取没食子酸标准品配制成质量浓度为 0、0.5、1、                     计测定荧光强度值（激发波长 488 nm，发射波长
            1.5、2 g/L 标准溶液，并依次加蒸馏水 1 mL、0.2 mol/L              500~600 nm），进一步测定细胞内活性氧（ROS）水
            福林酚 1 mL、质量分数 20%碳酸钠水溶液 500 µL，                    平，以试剂盒提供活性氧为阳性对照（试剂 Rosup，
            混合反应 1 h。以无没食子酸反应液为空白对照，检                          质量浓度 50 g/L）。
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