Page 108 - 《精细化工》2023年第8期

·1722· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 40 卷

1.2 方法 琼胶酶粗酶液在 35 ℃下振荡固定 3 h，得到黑色固
1.2.1 Fe 3 O 4 的制备 体颗粒，即为固定化琼胶酶。
采用化学沉淀法 [15] 制备 Fe 3 O 4 。称取 4.4483 g 1.2.6 琼胶酶活性测定
FeSO 4 •7H 2 O 和 7.5684 g FeCl 3 •6H 2 O，将其溶解在 用 DNS 法 [19] 测定琼胶酶活性。因为琼胶酶水解
320 mL 去离子水中，将 40 mL NH 3 •H 2 O 快速倒入溶 琼胶生成的琼胶寡糖具有还原糖性质，可与 DNS 发
液中，在 200 r/min 下机械搅拌反应 1 h。反应结束 生氧化还原反应，产物在煮沸后变色且在 540 nm 波
后，用磁铁分离沉淀物，并用无水乙醇冲洗沉淀物 长处有最大吸收峰，溶液颜色深浅与生成的还原糖
直至冲洗液清澈，将其置于真空冷冻干燥机–60 ℃下 含量呈正比，所以，可通过测定产物琼胶寡糖的产
干燥 3 h，得到黑色固体颗粒，即为 Fe 3 O 4 。 量进而计算出固定酶活力。
1.2.2 Fe 3 O 4 @SiO 2 的制备 琼胶寡糖产量计算方法为：利用葡萄糖制作还
在 ASLANI 等 [16] 方法基础上略作调整。称取 原糖标准曲线，称取葡萄糖加入超纯水中配成质量
0.5 g Fe 3 O 4 加入 40 mL 水和 80 mL 无水乙醇，在 浓度分别为 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、
200 r/min 下机械搅拌 2 min 使其分散，随即加入 0.8 g/L 的葡萄糖水溶液，各取 1 mL 不同质量浓度
3 mL TEOS 和 4 mL 氨水，继续机械搅拌 2 h。反应 的葡萄糖水溶液与 1 mL DNS 溶液混匀，并置于沸
结束后，用磁铁分离沉淀物，并用无水乙醇冲洗沉淀 水浴加热 5 min，冷却至室温，用超纯水将其定容到
物直至冲洗液清澈，将其置于真空冷冻干燥机–60 ℃ 10 mL，在 540 nm 处测定溶液的吸光度，然后绘制
下干燥 3 h，得到黑褐色固体颗粒，即为 Fe 3 O 4 @SiO 2 。 吸光值(y)-葡萄糖质量浓度(x)标准曲线（y=1.8562x+
2
1.2.3 Fe 3 O 4 @SiO 2 -NH 2 的制备 0.0022，R =0.9981）。将后续测定的各组样品吸光度
在 MIAO 等 [17] 方法基础上略作调整。称取 0.5 g 带入葡萄糖标准曲线，则可计算出琼胶寡糖产量。
Fe 3 O 4 @SiO 2 加入 150 mL 无水乙醇，在 200 r/min 下 游离琼胶酶的活性测定：称取 0.2 g 琼胶加入
机械搅拌 2 min 使其分散，随即加入 4 mL APTES， 100 mL 超纯水，加热搅拌至琼胶全部溶解后，将琼
继续机械搅拌 12 h。反应完毕后，用磁铁分离沉淀 胶溶液冷却至 35 ℃，用 0.1 mol/L 的 HCl 和 NaOH
物，并用无水乙醇冲洗沉淀物直至冲洗液清澈，将 调节 pH 为 7.5，得到制备好的琼胶溶液。取 1 mL
其置于真空冷冻干燥机–60 ℃下干燥 3 h，得到黑色 琼胶酶粗酶液在 35 ℃下水解 9 mL 琼脂溶液 30 min
固体颗粒，即为 Fe 3 O 4 @SiO 2 -NH 2 。 后，取 1 mL 反应后溶液加入到含有 1.0 mL DNS 溶
1.2.4 琼胶酶粗酶液的制备 液的比色管中，随后将其置于沸水浴中煮沸 10 min
采用本实验室早期筛选得到的 Microbulbifer sp. 显色。待溶液冷却至室温后，用蒸馏水将其稀释至
菌株（微泡菌，酶活为 25 U/mL，与 Microbulbifer sp. 10 mL，用紫外-可见分光光度计测定溶液在 540 nm
BS03 同源性为 99.79% ， Accession 编码为 处的吸光度。对固定化琼胶酶的活性测定方法同上，
HM596342）生产琼胶酶。在前期筛选实验的基础上 将 50 mg 固定化琼胶酶（磁性材料）加入 10 mL 琼
确定其液体培养基组分为蛋白胨 1 g、琼胶 2 g、 脂溶液（底物）中反应 30 min，在磁性材料和底物
FeSO 4•7H 2O 0.02 g、CaCl 2 0.2 g、MgSO 4 •7H 2 O 5 g、 磁分离后，取 1 mL 反应后溶液按照上述步骤测定其
NaCl 15 g、KCl 1 g、K 2 HPO 4 0.1 g、NH 4 Cl 2 g，H 2 O 在 540 nm 处的吸光度。对照组用灭活的游离酶与灭
1 L。用 0.1 mol/L 的 HCl 和 NaOH 溶液调节液体培 活的固定化酶进行测定。
养基 pH 为 7.5，在 121 ℃下高压灭菌 20 min，冷却 酶活力（U）定义为在分析条件下 1 mL 粗酶液
至 35 ℃后，在无菌操作台中将 Microbulbifer sp.菌 每分钟生成 1 μg 还原糖的酶量 [20] ，计算公式如式（1）
种接入液体培养基，在 35 ℃下振荡培养 24 h，即 所示：
得到种子培养液。将体积分数 1%的种子培养液接种 酶活力=1000×ΔA×n/t （1）
到不含蛋白胨的液体培养基中，并在 35 ℃下振荡 式中：ΔA 为琼胶寡糖产量，g/L；n 为稀释倍数；t
培养 48 h，得到的发酵液在 9000 r/min 下离心 10 min 为反应时间，min。
收集上清液，上清液作为琼胶酶粗酶液用于固定化。 1.2.7 酶固定化条件的优化实验
粗酶液中酶质量浓度用 Bradford 法 [18] 测定。 在 1.2.5 节基础上优化酶固定化条件，按表 1
1.2.5 固定化琼胶酶方法 进行实验，以减少试剂资源、节约成本，同时提高
称取 50 mg Fe 3 O 4 @SiO 2 -NH 2 载体，加入 2 mL 酶活回收率。酶活回收率计算式如式（2）所示：
戊二醛（质量分数 5%），超声分散 10 min 后，静置 酶活回收率/%=固定化酶酶活/游离酶酶活×100 （2）
交联反应 2 h，反应结束后，用磷酸盐缓冲溶液 在最优酶固定化条件下，计算固定化琼胶酶中
（0.1 mol/L，pH=7.5）洗去多余的戊二醛，加入 3 mL 酶的负载量（mg/g）：