Page 81 - 《精细化工》2019年第11期
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第 11 期                   朱   劼，等:  病毒样颗粒限域纳米催化剂提高催化加氢活性                                 ·2229·


            蛋白的表达量。根据前期单因素实验探索，本研究                             的 KBH 4 和 20 μL 1.7 μmol/L 的 Ru@CCMV 分散液。
            设计 IPTG 终浓度分别为 0.8、0.9、1.0 mmol/L，诱                其中，Ru 对 4-硝基苯酚的摩尔分数为 0.1%。反应
            导温度分别为 22、25、28  ℃，诱导时间分别为 12、                     在加入 Ru@CCMV 催化剂后随即开始，计时 15 min。
            15、18  h。通过考马斯亮蓝法测定不同条件下表达                         不同时间点采集样品数据。
            的可溶蛋白量，获取最佳表达工艺。                                       肉桂醛加氢反应的具体操作为：在 15 mL 反应
            1.2.4    蛋白纯化                                      釜中加入肉桂醛（10 mg）和 Ru@CCMV 分散液（其
                 首先，将得到的上清液在重组缓冲液（0.1 mol/L                    中，Ru 对肉桂醛的质量分数为 0.1%），用水稀释至
            NaAc，0.9 mol/L NaCl，0.01 mol/L MgCl 2 ，pH 5.0）     5 mL；接着，用 H 2 置换釜内空气 6 次，在 30  ℃、
            中透析，每 8  h 更换一次缓冲液，透析过夜，使可                         2.0 MPa、500 r/min 下反应 3 h。
            溶的 CCMV 衣壳蛋白重组成 VLPs；然后，在质量                            上述两个模型反应均以 Ru-CA 为对照，在相同
            分数 30%的蔗糖垫溶液中 40000 r/min 条件下超速离                   条件下进行。
            心 3 h；接着，将沉淀重悬于重组缓冲液中，在 4  ℃                           肉桂醛加氢反应催化剂回收：催化剂重复利用
            下保存。                                               3 次。每次反应结束后，首先将反应液置于重组缓
            1.2.5    Ru@CCMV 催化剂的制备                            冲液（见 1.2.4 节）中透析 2  d，每 8  h 换一次液，
                 将 1.2.4 节中保存的 CCMV  VLPs 分散液                  除去反应液中未反应的底物和产物；然后，将透析
            （0.4 g/L）与 RuCl 3 溶液（6 mmol/L）混匀，其中，               液超滤浓缩，用于下一次反应。
            n(Ru)∶n(CCMV CP)=15∶1，室温搅拌 30 min 后，               1.3    性能测试与表征
            向混合液中加入 0.1  mol/L  KBH 4 溶液，保持                        PCR 扩增的基因和重组质粒用质量分数 1%的
            n(KBH 4 )∶n(Ru)=5∶1，搅拌下反应 30 min。反应结               琼脂糖凝胶电泳检测；CCMV 核衣壳蛋白的表达和
            束后，将反应液再置于重组缓冲液（见 1.2.4 节）中                        纯化效果采用 SDS-PAGE 检测；CCMV  VLPs 和
            透析过夜。                                              Ru@CCMV 纳米颗粒的形态通过样品负染后用
                 以柠檬酸钠（CA）为配体，KBH 4 为强还原剂，                     TEM 观察。负染方法：将重组后样品稀释一定倍数，
            在室温下将 RuCl 3 直接还原生成 Ru 溶胶（Ru-CA）                   并取 10  μL 置于 400 目铜网上静置 1  min，随后用
            作为对照。制备过程为：先将 RuCl 3 （6  mmol/L）                   10 μL 质量分数为 1%的乙酸双氧铀进行负染。
            与 CA 溶液（质量分数 1%）混匀，保持 n(CA)∶                           CCMV  VLPs 对 Ru 纳米颗粒的封装率估算方
            n(Ru)=11∶1；然后，在剧烈搅拌下加入 0.1  mol/L                  法：选取 3 张不同位置的 TEM 图片，对每一张内封
            KBH 4 ，使 n(KBH 4 )∶n(Ru)=5∶1，反应 5 min。             装 Ru 纳米颗粒的蛋白纳米颗粒与总蛋白颗粒进行
            1.2.6    Ru@CCMV 催化剂的评价                            计数，计算封装率，并取平均值，得到总体封装率。
                 以 4-硝基苯酚和肉桂醛催化加氢为模型反应，                            4-硝基苯酚及加氢产物 4-氨基苯酚的检测：二
            考察了 Ru@CCMV 的催化活性。其反应路线如下所示。                       者分别在 400 nm 和 296 nm 处有最大光吸收，在反
                                                               应过程中使用多功能酶标采集数据，并以此为依据
                                                               作分析；肉桂醛及其加氢产物使用 Agilent  1260
                                                               HPLC 进行分析。测试条件为：使用 Hypersil ODS2
                                                               型色谱柱，流动相：体积分数 70%乙腈；柱温：25  ℃；
                                                               流速 1 mL/min；检测波长 205 nm；进样量 5 μL。

                                                               2    结果与讨论

                                                               2.1    目的基因扩增及重组表达载体的鉴定
                                                                   PCR 扩增反应后目的基因片段长 579 bp，目的
                                                               基因扩增及重组表达载体鉴定见图 1。如图 1a 所示，
                                                               泳道 1 在 500~750 bp 之间有一条明显的条带，与目
                                                               的基因的条带位置相符。重组质粒 pET32a-CCMV

                                                               （图 1b）经 NdeI 和 XhoI 双酶切后电泳，在约 580
                 4-硝基苯酚加氢在常温下进行，反应体系为                          和 5900  bp 位置出现 2 条基因片段，与目的基因和
            200 μL。具体操作为：在 96 孔酶标板中顺序加入                        pET32a 载体一致，表明目的基因成功插入 pET32a
            30 μL 1 mmol/L 的 4-硝基苯酚，150 μL 16 mmol/L           载体。
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