Page 80 - 《精细化工》2019年第11期
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·2228·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                  第 36 卷

            的翻译后修饰，导致表达出的蛋白多肽链因空间折                             1.2   方法
            叠不正确而形成大量的不溶性包涵体沉淀                    [7-8] ，大大    1.2.1    基因工程菌的构建
            增加了 VLPs 复性和纯化的难度。因此，开发具有                             （1）基因克隆：委托上海佑隆生物科技有限公
            低成本，能实现体外高效、可控的组装，可大规模                             司利用本实验室保存的天然 CCMV 病毒 RNA 进行
            生产病毒样颗粒的制备技术越来越受到重视。                               反转录得到的模板 DNA，并设计合成相应的引物，
                 由于仅少量的异源基因在原核细胞中能表达活                          CCMV-F  5GATATAGGATCCATGAGTACCGTTG3，
            性可溶蛋白（构象上正确折叠的蛋白），为了提高异                            CCMV-R 5TGCTCGAGGTAGACCGGGGTAAAG3。
            源蛋白在原核细胞中的可溶表达效率，人们在开发                                 PCR 过程：采用 PCR 试剂盒进行扩增反应，反
                     [9]
            强启动子 ，与分子伴侣共表达               [10] 和使用融合蛋白          应体系为：10×扩增缓冲液 10 μL，4 种脱氧核糖核
            等方面进行了许多研究。其中，使用融合蛋白是提                             苷三磷酸（dNTP）混合物各 200  μmol/L，引物各
            高重组蛋白溶解度的最有效方法之一。目前已经开                             10~100 pmol，模板 DNA 0.1~2 μg，Taq DNA 聚合
            发了几种融合蛋白，例如：类泛素蛋白修饰分子                       [11]   酶 2.5 μL，MgSO 4  1.5 mmol/L，加双蒸水至 100 μL。
            （SUMO）、谷胱甘肽 S 转移酶            [12] （GST）、麦芽糖        PCR 反应条件：96  ℃预变性 5 min，96  ℃变性 30 s，
            结合蛋白     [13] （MBP）和硫氧还蛋白        [14] （Trx）等，      56  ℃退火 30 s，72  ℃延伸 30 s，30 个循环，最后
            用于增强蛋白质表达和促溶纯化               [15] 。然而，融合蛋          72  ℃延伸 10 min。
            白的切除往往需要价格昂贵的酶，增加了工艺成本                                （2）质粒重组：T4 DNA 连接酶连接 CCMV 衣
            及难度。原核表达中包涵体的产生一方面由于缺少                             壳蛋白目的基因片段和载体 pET32a，得到重组质粒
            翻译后修饰引起，另一方面因原核表达过快引起蛋                             pET32a-CCMV。用 NdeI 和 XhoI 内切酶进行双酶切
            白错误折叠导致        [16] 。因此，通过优化原核表达工艺                 回收 CCMV 衣壳蛋白目的基因片段及载体 pET32a。
            条件，减少因表达过快而产生包涵体，是在体外实                             通过 质量分数 1%琼脂糖凝 胶电泳对重 组质 粒
            现低成本可溶蛋白表达的一种有效解决方案。                               pET32a-CCMV 进行双酶切验证。
                 本研究通过构建重组质粒 pET32a-CCMV，实                        （3）基因工程菌的制备：取 10 μL 载体 pET32a-
                                                               CCMV 与 100 μL E.coli BL21（DE3）感受态细胞轻
            现了 CCMV 衣壳蛋白在 E.coli BL21 的异源表达，
            并开发出 CCMV  VLPs 限域 Ru 纳 米催化剂                       轻混合后冰浴 30  min，转移至 42  ℃水浴中 90  s，
                                                               冰浴 2 min 后加入 0.5 mL 新鲜的 LB 液体培养基混
            （Ru@CCMV），用于 4-硝基苯酚（4-NP）和肉桂
                                                               合。然后，在 37  ℃水浴中静置培养 1~2 h，取转化
            醛（CAL）催化加氢两个模型反应。目前，病毒样
                                                               液 100 μL 涂布于含 60 mg/L 氨苄青霉素的 LB 固体
            颗粒限域催化剂用于催化加氢的报道较少。本研究
                                                               平板上，37  ℃下保温 24 h。筛选得到的基因工程菌
            为 CCMV  VLPs 在绿色化学和催化领域的应用提供
                                                               记为 CCMV-BL21。
            了实验基础。
                                                               1.2.2    蛋白表达
            1    实验部分                                              复苏 CCMV-BL21 菌种，37  ℃过夜培养活化。
                                                               次日，活性菌液以体积比 1∶50 扩大培养 800 mL，
            1.1    试剂与仪器                                       37  ℃培养至吸光度 A 600 =0.4~0.6，加入 0.5  mmol/L
                 质粒、菌株及培养基：原核表达载体 pET32a                       的 IPTG，37 ℃诱导表达 5 h。发酵结束后，在 4  ℃、
            和大肠杆菌 BL21（DE3）购自上海佑隆生物科技有                         8000 r/min 下离心 5 min，收集菌体。加 40 mL 分解
            限公司；LB 培养基：10  g/L 胰蛋白胨，5  g/L 酵母                  缓冲液〔0.02 mol/L Tris-HCl，0.9 mol/L NaCl，0.001
            提取物，10 g/L NaCl。                                   mol/L  二硫苏糖醇（DTT），pH 7.4〕进行超声波裂
                 氨苄青霉素、异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），                        解。裂解条件：冰浴、功率 300 W、超声 3 s 间隔 7
            上海 Solarbio 公司；蛋白 Marker、上样缓冲液，大                   s、时间 15 min。裂解后，在 4  ℃、12000 r/min 下
            连 TaKaRa 公司；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒、聚                     离心 15 min，分别收集上清液和沉淀。将沉淀重悬
            合酶链式反应（PCR）扩增试剂盒，上海生工生物                            于 80 mL 含 8 mol/L 尿素的分解缓冲液（8 mol/L 尿
            工程有限公司；肉桂醛、4-硝基苯酚，CP，国药集                           素，0.02 mol/L Tris-HCl，0.9 mol/L NaCl，0.001 mol/L
            团化学试剂有限公司。                                         DTT，pH 7.4）中，超声促溶。以不添加 IPTG 为对
                 Optima XPN 智能型超速离心机，美国 Beckman-               照，考察 IPTG 对蛋白表达的影响。
            Coulter 公司；Spark  10M 型多功能酶标仪，瑞士                   1.2.3    蛋白表达工艺的优化
            Tecan 公司；JEM  2011 型透射电镜，日本电子株式                        根据小试的蛋白表达工艺，分别对 IPTG 终浓
            会社；DCYZ-24DN 型电泳仪，北京六一仪器厂。                         度、诱导温度以及诱导时间进行优化，以提高可溶
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