Page 98 - 《精细化工》2020年第3期
P. 98

·516·                             精细化工   FINE CHEMICALS                                  第 37 卷

            和(R)-对氯苯基乙二醇（p-chlorophenyl-1,2-ethanediol,        水溶解并定容至 1 L，4 ℃保存备用。
            pCPED）   [4]  是合成 NMDA 受体拮抗剂依利罗地                   1.1.2    试剂和仪器
                                                                                                          [14]
            （Eliprodil）的手性砌块，(R)-Eliprodil 在治疗抑郁                   rac-pCSO 由本实验室合成（HPLC 纯度>99%） ；
            症方面发挥着重要的作用。                                       吐温-20（Tween-20）、吐温-80（Tween-80）、曲拉通
                 目前，化学法合成(R)-pCSO 反应条件严苛，底                     X-100（TritonX-100）、蓖麻油聚氧乙烯醚-40(EL-40)、
            物谱窄且需贵金属络合物作手性催化剂                   [5-6] 。EHs 具   聚乙烯醇-124（PVA-124）和泊洛沙姆-188 (Poloxamer-
            有不需辅酶、催化效率高、反应条件温和等优点，                             188)，AR，国药集团化学试剂有限公司。
            因而越来越受到重视。研究发现多种 EHs 可催化                               Waters e2695 高效液相色谱仪和 Waters 2489 检
            rac-pCSO 的水解动力学拆分制备(R)-pCSO，但存在                    测器，美国 Waters 公司；Chiralpak® AS-H（250 mm ×
            对映选择性较低、产物/底物抑制等缺陷，阻碍了其                            4.6 mm × 5 μm）色谱柱，上海大赛璐药物手性技术
                                     [7]
            在工业上的应用。如 HU 等 在绿豆（Vignaradiata）                   有限公司。
            中克隆的 VrEH3 对 rac-pCSO 的对映体 比率                      1.2    E. coli/pveh1 Z4X4-59  的诱导表达
                                                     [8]
            （enantiomeric ratio, E）仅为 6.8。KOTIK 等 从宏               挑取 E. coli/pveh1 Z4X4-59  单菌落接种于 2  mL 新
            基因组克隆的 Kau2 催化 rac-pCSO 的 E 为 35，但初                鲜的 LB 培养基中（含 100 mg/L 卡那霉素），37 ℃、
            始底物浓度仅为 3.5 mmol/L。土豆（Solanumtuberosum）            220 r/min 培养 12 h，将 2 mL 培养液转接到 100 mL
            StEH 对 rac-pCSO 具有较高对映选择性（E=70），当                  新鲜 LB 培养基中，培养 2~3 h 至 OD 600 为 0.6~0.8，
            初始底物浓度大于 200  mmol/L 时存在明显抑制作                      加入 0.1 mL IPTG（500 mmol/L）至终浓度为 0.5 mmol/L，
            用 [9-10] 。近年来，非水相酶催化技术日趋成熟，在                       20 ℃、220 r/min 诱导 10 h，离心收集菌体。
            反应体系中添加有机溶剂、离子液体或表面活性剂                             1.3    E. coli/pveh1 Z4X4-59  全细胞酶活力测定
            等，可有效提高有机底物/产物的溶解度和稳定性，                                取 100 μL 50 mg/L 菌悬液，加 850 μL 缓冲液混
            且能改善酶催化特性          [11-12] 。                       合均匀，于 25 ℃孵育 5  min，加入 50  μL  200  mmol/L
                 本实验室前期从菜豆（Phaseolus vulgaris）中挖               rac-pCSO 至终浓度为 10 mmol/L，于 25 ℃、220 r/min
            掘出一种新型的环氧化物水解酶（PvEH1, GenBank:                     反应 10 min。吸取 100 μL 反应液用 1 mL 乙酸乙酯
            KR604729）   [13] ，并以 PvEH1 为模板成功构建了一               萃取，上层有机相用无水 MgSO 4 干燥。流动相为
            株催化性质优良突变体 PvEH1            Z4X4-59 （L105I/V106I/   V(正己烷)∶V(异丙醇)=80∶20，流速为 0.8 mL/min，
            M160A/M175I/S178T/P184W）。以 E. coli/pveh1  Z4X4-59  检测波长为 220  nm，色谱柱温为 30 ℃。在上述条
            全细胞催化 10 mmol/L rac-pCSO 〔53.2 U/g wet cell        件下，每分钟催化 1 μmol pCSO 转化成 pCPED 所需
            （wc）,  E=26.5〕的酶活力和对映选择性较 PvEH1                    的酶量定义为一个酶活力单位（U）。计算 rac-pCSO
            （12.7 U/ g wc, E=2.2）分别提高 4.2 和 12 倍。本研            的转化率 c〔公式（1）〕、全细胞酶活力（U/g wc）
            究利用 E. coli/pveh1 Z4X4-59  全细胞作为催化剂动力学             〔公式（2）〕。
                                                                                        )R 
            拆分 rac-pCSO 制备(R)-pCSO（合成路线如下式）。                                     (  p  S  
                                                                                       p
                                                                      c /%                       100    （1）
            考察了 6 种非离子型表面活性剂，并优化了酶促反                                        [(R   s  S s  ) (R  p    S   p  )  ]
            应条件，旨在为绿色、高效合成(R)-pCSO 提供一种                                                 C 
                                                                                           V c
                                                                       全细胞酶活力      /%   0        100    （2）
                                                                                          
            新思路。                                                                          tm
                                                               式中：R s 和 S s 表示(R)-pCSO 和 (S)-pCSO 的峰面积，

                                                               R p 和 S p 表示 (R)-pCPED 和 (S)-pCPED 的峰面积；ε
                                                               为摩尔消光系数，ε= 1.0399 L/(mol∙cm)；C 0 为初始
                                                               底物浓度，mmol/L；V 为体积，mL；t 为反应时间，
            1    实验部分                                          min；m 为全细胞质量，g。
                                                               1.4    缓冲液体系中 E. coli/pveh1   Z4X4-59  全细胞动力
            1.1    材料与仪器                                           学拆分 rac-pCSO
            1.1.1    菌株、培养基和缓冲液                                    构建缓冲液体系，其包含 200 mg E.coli/pveh1      Z4X4-59
                 重组菌 E. coli/pveh1 Z4X4-59  由本实验室构建并保          湿菌体和不同初始浓度 rac-pCSO（150~500 mmol/L），
            存；LB 培养基：胰蛋白胨 10 g/L、酵母提取物 5 g/L                   分别于 25 ℃、220 r/min 反应不同时间，参照 1.3 节
            和 NaCl 10 g/L，pH=7.2；磷酸盐缓冲液（Na 2 HPO 4 -           进行样品分析，计算 (R)-pCSO 的对映体过量值 ee s
            NaH 2 PO 4 ,  100  mmol/L,  pH=7.0 ）：称 取 4.99  g   〔公式（3）〕、(R)-pCPED 的对映体过量值 ee p 〔公
            NaH 2 PO 4 ·2H 2 O、60.2 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O，用去离子  式（4）〕。
   93   94   95   96   97   98   99   100   101   102   103