Page 99 - 《精细化工》2020年第3期

第 3 期 王婷婷，等: 吐温/缓冲液体系中酶法合成(R)-对氯环氧苯乙烷 ·517·

R  S turnover frequency, aTOF），指单位时间内，单位质
s
ee s /%  R  S s  100 （3） 量的酶催化反应所获得的产物总量，g/(h·g) 。时空
[2]
s
R  S s 产率（space-time yield,STY）指在一定反应条件下，
p
ee p /%  R  S p p  100 （4） 单位时间单位体积所能获得的目的产物的总量，单
p
[7]
1.5 表面活性剂对 E. coli/pveh1 Z4X4-59 全细胞酶活 位 g/(L·h) 。
力和对映选择性的影响 1.8 吐温-20/缓冲液体系中 E. coli/pveh1 Z4X4-59 全细
构建表面活性剂/缓冲液反应体系，其包含 50 mg 胞动力学拆分高浓度 rac-pCSO
E. coli/pveh1 Z4X4-59 湿菌体、300 mmol/L rac-pCSO 和 在最佳反应条件下放大反应体系，于 250 mL 圆
10%（体积分数）的表面活性剂（Tween-20、Tween-80、 底烧瓶中加入 96 mL 缓冲液、20 g E. coli/pveh1 Z4X4-59 湿
Triton X-100、EL-40、PVA-124 或 Poloxamer-188）， 菌体（200 g/L），4 mL 吐温-20（4%，体积分数），
分别于 25 ℃、220 r/min 反应 10 min，参照 1.3 节进 12.4 g rac-pCSO（800 mmol/L），于 25 ℃恒温水浴、
行样品分析，计算 E. coli/pveh1 Z4X4-59 全细胞的酶活 磁力搅拌进行反应。定时取样并参照 1.3 节进行样
力及 E〔公式（5）〕。 品分析，当(S)-pCSO 完全转化完时，用 300 mL 乙
(1 c  ) (1 ee ) 酸乙酯萃取 3 次，萃取液用饱和 NaCl 洗 3 次，加入


E  s （5）
ln


(1 c  ) (1 ee s ) 无水 Na 2 SO 4 干燥，减压蒸除溶剂获得产物，经硅胶
式中：c 为 rac-pCSO 的转化率，%；ee s 为(R)-pCSO 柱层析纯化获得(R)-pCSO。测定其核磁共振氢谱和
的对映体过量值，%。 比旋光度。
1.6 吐温-20 对突变酶 PvEH1 Z4X4-59 稳定性的影响
于 E.coli/pveh1 Z4X4-59 菌悬液中添加 10%（体积 2 结果与讨论
分数）吐温-20，25 ℃、220 r/min 孵育不同时间，
2.1 缓冲液体系中 E. coli/pveh1 Z4X4-59 全细胞动力
每 3 h 取样 100 μL 50 mg/L 菌悬液，冰浴至室温后，
学拆分 rac-pCSO
参照 1.3 节测定全细胞残余酶活力。对照组为不加
以 E. coli/pveh1 Z4X4-59 全细胞作为催化剂，在缓
吐温-20 的菌悬液。以未处理的菌悬液的酶活力为
25 定义为 冲液体系中水解动力学拆分不同初始浓度的 rac-
100%，计算相对酶活力。酶的半衰期 t 1/2
E. coli/pveh1 Z4X4-59 全细胞经 25 ℃处理残余酶活力 pCSO，结果见图 1。当底物初始浓度分别为 100、
为 50%时所对应的反应时间。 150、200 和 250 mmol/L 反应 1.0、1.5、2.0 和 3.0 h
1.7 吐温-20/缓冲液催化体系的优化 时，(R)-pCSO 的 ee s 均达到 99.9%，而当底物初始
1.7.1 吐温-20 添加量 浓度为 300、350、400 和 500 mmol/L 反应 12 h 时，
构建吐温-20/缓冲液反应体系，其包含 200 mg E. ee s 仅为 47.3%~80.7%。结果表明，在缓冲体系中，
coli/pveh1 Z4X4-59 湿菌体、300 mmol/L rac-pCSO 和不 E. coli/pveh1 Z4X4-59 全细胞最高可有效拆分 250 mmol/L
同体积分数吐温-20（0、2%、4%、6%、8%或 10%）， rac-pCSO。此外，当底物初始浓度高达 500 mmol/L
分别于 25 ℃、220 r/min 反应 3 h，参照 1.3 节进行 时，转化率为 74.1%，产物浓度高达 370 mmol/L，
样品分析，测定底物 ee s 。 表明 PvEH1 Z4X4-59 具有较高底物和产物耐受性。E.
1.7.2 rac-pCSO 的初始浓度 coli/pveh1 Z4X4-59 全细胞无法拆分高浓度 rac-pCSO，
构建吐温-20/缓冲液反应体系，其包含 200 mg E. 可能是由于 PvEH1 Z4X4-59 的稳定性较低。
coli/pveh1 Z4X4-59 湿菌体、4%（体积分数）吐温-20
和不同初始浓度（300、800 或 900 mmol/L）rac-pCSO，
分别于 25 ℃、220 r/min 反应。定时取样并参照 1.3
节进行样品分析，测定底物 ee s 和转化率 c。
1.7.3 E. coli/pveh1 Z4X4-59 全细胞添加量
构建吐温-20/缓冲液反应体系，其包含不同质量
浓度 E. coli/pveh1 Z4X4-59 湿菌体（50、100、150、
200 g/L）、4%（体积分数）吐温-20 和 800 mmol/L
rac-pCSO，分别于 25 ℃、220 r/min 反应 12 或 24 h。

参照 1.3 节进行样品分析，测定底物 ee s 和转化率 c。
图 1 E. coli/pveh1 Z4X4-59 全细胞动力学拆分 rac-pCSO
产率指所保留的单构型环氧化物物质的量与初始外
Fig. 1 Kinetic resolution of rac-pCSO by whole cells of E.
消旋环氧化物物质的量之比。平均转化率（average coli/pveh1 Z4X4-59