Page 220 - 《精细化工》2020年第9期

·1934· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 37 卷

中的蜡组分，原油黏度降低 80%。ZHOU 等 [10] 分离 素 1.80 g，MgSO 4 •7H 2 O 0.2 g，以上均为 AR，国药
得到一株 Geobacillus stearothermophilus strain A-2， 集团化学试剂有限公司；纯水 1 L。
发现该菌能够优先降解碳原子数大于 21 的长链正 正癸烷、正十四烷、液体石蜡、煤油、LB 营养
构烷烃、萘和甲基化菲，以 C28 为单一碳源培养的 琼脂，化学纯，国药集团化学试剂公司；DP302 细
降解率最高为 89.83%。 菌基因组 DNA 提取试剂盒，天根生化科技（北京）
此外，有些微生物在生长代谢过程中产生表面 有限公司；PAGE 纯化通用引物 27F 和 1492R，生
活性剂，它是由疏水端和亲水端组成的两亲性化合 工生物工程（上海）股份有限公司。
物，易于与各种极性的界面相互作用，降低溶液的 HZQ-C 空气浴振荡器，哈尔滨市东联电子技术
表面和界面张力，使烃类乳化和溶解，从而提高烃 开发有限公司；台式高速离心机，湖南可成仪器设
类的生物利用度 [11-12] 。ZHANG 等 [13] 发现，Bacillus 备有限公司；UV-2550 紫外-可见分光光度计，上海
amyloliquefaciens strain 6-2c 产生的脂肽类生物表面 科恒实业发展有限公司；JJ2000B 旋转滴界面张力
活性剂能够提高生物利用度，促进烃类被降解，经 测量仪，上海中晨数字技术设备有限公司；Nicolet
过该菌处理后，清蜡率可达 50.82%~95.17%。LIU iS10 傅里叶变换红外光谱仪，美国 Thermo 公司；
等 [14] 分离纯化得到一株 Pseudomonas aeruginosa Q2000 DSC 差示热量扫描仪，美国 TA 梅特勒-托利
SNP0614，发现其产生的脂肽类生物表面活性剂能 多公司；HAKKE 流变仪，上海珩璟科技有限公司；
够显著降低界面张力，并且对原油的乳化活性高达 梯度 PCR 仪，德国 Eppendorf 公司；BX-51 偏光显
90%。添加表面活性剂后，能提高混合菌对正构烷烃 微镜，日本奥林巴斯有限公司；高精度电子天平，
的降解率。 BEZZA 等 [15] 分离得 到一 株 Bacillus 常熟市双杰测试仪器厂。
subtilis CN2，其产生的生物表面活性剂能够使废机 1.2 菌株特性测定
油中的芳烃组分降解率提高 82%，与不添加表面活 1.2.1 菌株分离与鉴定
性剂相比，降解率提高了 2 倍多。 将 6 g 原油污染淤泥加入到盛有 100 mL 经灭菌
目前，假单胞菌、不动杆菌、芽孢杆菌、节杆 的无机盐培养基的锥形瓶中，并添加培养基体积分
菌等产表面活性剂烃降解菌已经得到了很好的研 数 0.5%的液体石蜡（下同）作为碳源。在 130 r/min，
究 [16-17] 。然而，关于产生物表面活性剂的中间苍白 38 ℃培养 2 d 后，淤泥分散于培养基中。然后，将上
杆菌研究相对较少。本文从大庆油田污染淤泥中以 清液按培养基体积的 2%（下同）转接到新鲜的培养
液体石蜡为唯一碳源分离纯化得到一株产表面活性 基中，并添加体积分数 1%液体石蜡作为碳源，当培
剂的中间苍白杆菌 F-1，并对其产生的表面活性剂进 养基出现浑浊时再次转接至新的培养基中，每次转
行评价与鉴定，并从原油黏度及蜡含量变化考察该
接增加体积分数 1%液体石蜡，并且逐步提升至 5%。
菌对含蜡原油除蜡降黏的作用效果。
转接完成后，将 0.1 mL 菌液按浓度梯度稀释，
1 实验部分 涂布于 LB 营养琼脂平板上，放入培养箱中恒温培
养。当菌落长出时，挑选单个菌落进行反复划线纯
1.1 试剂与仪器 化，逐步分离出烃降解菌。
1.1.1 菌株与油样 采用细菌 DNA 提取试剂盒提取分离得到菌株
实验所用菌株与含蜡原油均来自大庆油田。菌 F-1 总的 DNA，利用通用引物 27F 和 1492R 进行
株 F-1 从长期受大庆原油污染淤泥中分离纯化得到。 16S rDNA 片段扩增。正向引物 27F 序列为
3
油样密度为 873 kg/m ，蜡含量 15.2%，析蜡点为 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；反向引物 1492R
50.17 ℃，析蜡峰温 24.11 ℃，属于高含蜡原油。 的序列为 5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’。并进
1.1.2 试剂与仪器 行电泳。采用 PCR 仪扩增，对产物进行 Sanger 测序，
无机盐培养基：K 2 HPO 4 5 g，KH 2 PO 4 5 g，NaCl 并利用 Contig Express 拼接程序进行拼接。获得菌
5 g，MgSO 4 •7H 2 O 0.5 g，(NH 4 ) 2 SO 4 1 g，NaNO 3 1 g， 株 F-1 的 16S rDNA 基因序列，将序列提交 GenBank
尿素 0.5 g，以上均为 AR，国药集团化学试剂有限 数据库进行 Blast 比对分析，鉴定种属信息 [18] 。
公司；纯水 1 L。 1.2.2 菌株生长优化实验
微量元素液：ZnSO 4 0.01 g，FeSO 4 0.10 g， 将菌液以体积分数 2%接种量添加至 100 mL 无
CaCl 2•2H 2 O 0.01 g，MnSO 4 0.01 g，CuSO 4 •5H 2 O 0.01 g， 机盐培养基中，并添加 2 mL 液体石蜡为唯一碳源，
CoCl 2 0.01 g，H 3 BO 4 0.01 g，NaMoO 4 0.01 g，以上 在恒温摇床中 130 r/min 恒温培养，每隔 12 h 采用
均为 AR，国药集团化学试剂有限公司；纯水 1 L。 紫外-可见分光光度计测定菌液在不同温度和 pH 条
缓冲液：K 2 HPO 4 22.20 g，KH 2 PO 4 7.26 g，尿 件下的生长情况。