Page 121 - 《精细化工》2021年第7期
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第 7 期             纪   亮，等:  等离子体预处理对解淀粉芽孢杆菌生长和 α-淀粉酶分泌的影响                               ·1403·


                 淀粉酶是近年来引起工业界广泛关注的一类                           菌 CICC 10035 进行预处理，考察处理工艺条件对菌
            酶，约占世界酶市场份额的 25%。由于 α-淀粉酶在                         体生长和产酶活性的影响，筛选最佳工艺条件；通
            食品、医药、造纸、酿酒和纺织工业的淀粉水解过                             过基于 Label-free  定量蛋白质组学技术并结合生物
            程中起着至关重要的作用，是中国工业酶制剂的重要                            信息学技术，对比处理前后菌体内蛋白组的变化差
            组成成员    [1-4] 。微生物来源的淀粉酶因稳定性更高而在                   异，分析其基因本体（GO）富集功能和细胞代谢及
            工业应用中更受重视         [3-5] 。在诸多已商业化的 α-淀粉             信号转导通路（简称 KEGG 代谢通路），探讨可能
            酶生产菌属中，芽孢杆菌属因其抗性强、能分泌孢                             的产生机制。
            外酶等优势备受关注          [4-5] 。
                 科研人员利用芽孢杆菌生产淀粉酶的研究主要                          1   实验部分
            在对高产菌株的筛选           [6-9] 和对发酵培养基的选择优              1.1   试剂与仪器
            化 [3,5,10-11] 上。对高产菌株的筛选通常采用菌种诱变                       KH 2 PO 4 、K 2 HPO 4 •3H 2 O、(NH 4 ) 2 SO 4 、MgSO 4 •
                                                   [8]
            和基因重组等手段进行。例如，ZHAO 等 通过敲
                                                               7H 2 O、MnSO 4 •H 2 O、FeSO 4 •7H 2 O、CaCl 2 •2H 2 O、
            除产孢子相关的基因，降低了解淀粉芽孢杆菌
                                                               NaCl、Na 2 HPO 4 •12H 2 O、一柠檬酸（C 6 H 8 O 7 •H 2 O）、
            （Bacillus amyloliquefaciens）205 的孢子形成率，使
                                                               可溶性淀粉、乙酸，AR，国药集团化学试剂有限公
            α-淀粉酶的分泌量得到极大提高。而对发酵培养基
                                                               司；琼脂粉，BR，国药集团化学试剂有限公司；胰
            的优化，主要集中在筛选廉价的农林和餐厨废弃物                             蛋白胨、酵母提取物，BR，安琪酵母股份有限公司。
            上。例如，BHATT 等       [11] 以 Bacillus amyloliquefaciens
                                                                   HD-2N 型冷等离子体改性处理仪，常州中科常
            KCP2 为菌种，利用餐厨垃圾，通过固态发酵方式
                                                               泰等离子体科技有限公司；THZ-072HT 型数控恒温
            生产 α-淀粉酶，并对培养条件进行优化，结果表明，
                                                               摇床，上海博彩生物科技有限公司；YJ-VS 型超净
            在料水质量比 3∶1、pH 8 和 37 ℃下发酵 72 h，可
                                                               工作台 ，无 锡一净 净化 设备有 限公 司； LDZX-
            获得最大 α-淀粉酶产量。这些研究为工业淀粉酶的
                                                               50KBS 型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械
            应用和开发奠定了良好的基础。然而，它们在工业
                                                               厂；TG16 型高速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有
            技术推广上也存在一些缺陷，如菌种筛选时间长、
                                                               限公司；Spark 10M 型多功能酶标仪，瑞士帝肯集
            研究过程复杂、技术要求相对较高、培养基成分不
                                                               团；756S 型紫外-可见分光光度计，上海冷光技术有限
            稳定等。另外，这些研究过程也会产生一定的环境
                                                               公司；LS126C 型紫外线照度计，林上科技有限公司。
            污染和生物安全问题。
                                                               1.2   菌株和培养基
                 等离子体是除气体、液体和固体之外的第 4 种
            物质形态     [12] 。近年来，冷等离子体处理技术因其快                        菌株：解淀粉芽孢杆菌 CICC 10035，本实验室
                                                               保藏。
            速、经济、无污染、高效、可与生物组织或细胞之
                                                                   LB 液体培养基（g/L）：胰蛋白胨 10，酵母提
            间发生复杂而可控的生化过程等优势，在一些与生
            物体相关的领域如灭菌           [13-16] 、微生物诱变   [17-20] 、种   取物 5 和 NaCl 10，pH 7.0。固体培养基加 1.5%（质
            子萌发和幼苗生长         [21-25] 等，越来越受到人们的青睐。             量分数）琼脂。
                                                                   发酵培养基（g/L）：KH 2 PO 4  1.7，K 2 HPO 4 •3H 2 O
            目前，人们对冷等离子体技术的应用主要集中在常
                                                               5.7，(NH 4 ) 2 SO 4  2.6，可溶性淀粉 10，MgSO 4 •7H 2 O
            压室温等离子体（ARTP）上。这种技术操作简易，
            并容易实现连续化工作。ZHANG 等                [17] 采用 ARTP     0.195，MnSO 4 •H 2 O 0.05，FeSO 4 •7H 2 O 0.05，CaCl 2 •
                                                               2H 2 O 0.003。
            技术处理热带假丝酵母（Candida tropicalis），用于
                                                               1.3   菌体平板的制备
            木糖醇生产。经选育得到一株突变菌，发酵产生的
                                                                   将解淀粉芽孢杆菌接种至 LB 液体培养基中，
            木糖醇量达 0.61 g/g。与原始菌种相比，收率提高
                                                               30 ℃、180 r/min 下培养 16 h，吸取活化后的菌液
            约 22%。然而，ARTP 也存在一些问题，如它所产
                                                               100 L 均匀涂布于 LB 固体培养基上，置于 30 ℃恒
            生的等离子体能量较低，无法在材料表面发生因光
                                                               温培养。待菌体扩增铺满平板后准备预处理。
            子碰撞引起的光化学反应。而低真空室温等离子体
                                                               1.4   冷等离子体预处理
            （LVRTP）可有效解决等离子体能量较低的缺陷，
            大大缩短处理时间，提高处理效果。例如，LI 等                     [22]       本研究使用冷等离子体改性处理仪对菌体进行
                                                               预处理，其工作示意图如图 1 所示。
            研究表明，等离子体预处理对大豆种子的萌发和幼
                                                                   将长有菌落的平板置于腔体内，以氦气（He）
            苗生长有积极作用，经低真空室温射频放电等离子
            体处理 15 s，其发芽率和活力指数与未处理大豆种                          为工作气体，通过射频电源（13.56 MHz）放电，在
            子相比分别提高 14.66%和 63.33%。                            处理腔体中产生等离子体，对平板内的微生物菌体
                 本研究利用 LVRTP 处理技术，对解淀粉芽孢杆                      进行处理。处理条件为：放电功率 80~160 W，工作
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