Page 122 - 《精细化工》2021年第7期

·1404· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 38 卷

气压 120~180 Pa，预处理时间 10~30 s。处理结束后， 1.7 Label-free 蛋白质组检测分析
取出平板，4 ℃冰箱保存备用。所有对照样菌体不 根据单因素实验结果，选取最佳工艺条件对菌
放电，将长有菌落的平板放入腔体内抽真空，压强 体进行等离子体预处理，然后发酵至对数生长期后
为 135 Pa，放置 15 s。 期（约 28 h），离心收集菌体；接着经蛋白质提取、
酶解和液相色谱-质谱检测，鉴定菌体中的差异蛋白
质，并对其进行 GO 富集分析和 KEGG 代谢通路分析。

2 结果与讨论

2.1 射频放电功率对菌体生长和分泌 α-淀粉酶的
影响
使用 80~160 W 射频放电功率对菌体进行冷等
离子体预处理，工作气压和预处理时间保持恒定

（135 Pa 和 15 s），其发酵过程中的生长曲线如图
图 1 冷等离子体改性处理仪工作示意图 2a 所示。首先，菌种接种约 12 h 内，处理样和对照
Fig. 1 Schematic diagram of cold plasma modification
treatment instrument 样之间的差异较小。这是由于菌种接种时间不长，
培养基中的菌体浓度较低。之后，5 个处理样本的
等离子体辉光放电过程中紫外光辐射强度和能
生长明显快于对照样。菌种接种后 24 h，对照样进
量密度检测：使用手持式紫外线照度计，将探头紧
入稳定期，菌体浓度基本恒定；而处理样的菌体浓
贴等离子体处理仪腔体壁上的石英玻璃观察孔，检
度继续缓慢上升，其中以放电功率 120 W 处理的菌
测 UVC 区域（200~280 nm）的表观紫外光辐射强度。
种最为显著。接种 48 h 后，对照样的 OD 600 值仅为
1.5 菌体生长曲线的测定
2.48±0.07，而 120 W 处理样的 OD 600 值达 3.35±0.09，
用接种环从处理过的微生物平皿中挑取菌体至
提高了约 35%。然而，当发酵时间达 60 h 时，对照
发酵培养基中，30 ℃、180 r/min 条件发酵培养 48 h，
样的 OD 600 值开始下降，为 2.39±0.07；而此时 120 W
每 4 h 取 2 mL 菌液，用无菌水稀释一定倍数，通过
处理样 OD 600 值依然保持相对稳定（3.44±0.08）。结
多功能酶标仪测定其 OD 600 值。每组 5 个平行样。
果表明，对照样菌体生长曲线在 48~60 h 内进入衰
以未处理的菌体作为对照。
亡期；而处理样在相同时间内处于稳定期。可见，
1.6 α-淀粉酶酶活测定
等离子体预处理有延缓菌体衰亡的趋势。
发酵 48 h 后，将发酵液以转速 3500 r/min 离心
取发酵 48 h 的菌液，分析菌体分泌到发酵液中
10 min，取上清液作为发酵酶液，存于 4 ℃冰箱中
的 α-淀粉酶酶活，结果如图 2b 所示。随着放电功率
保存备用。取质量分数为 1%可溶性淀粉溶液 2 mL，
的提高，菌体分泌到发酵液中的 α-淀粉酶酶活呈先
加入磷酸缓冲液（pH 6.0）1 mL，40 ℃预热 5 min，
上升后下降的趋势。当放电功率为 80 W 时，测出
加入稀释 10 倍的发酵酶液（用磷酸缓冲液稀释），
的酶活仅为(331±10) U/mL，与对照样相仿〔(330±
40 ℃反应 30 min，加入 0.5 mol/L 的乙酸溶液 10 mL
12) U/mL〕，而当放电功率提高至 120 W 时，酶活达
终止反应。吸取反应液 1 mL 加入 10 mL 工作碘液
到最高，为(380±10) U/mL。与对照样相比，酶活提
显色，利用紫外-可见分光光度计测定其在 660 nm
高约 15%。若放电功率继续提高，酶活开始下降，
波长下的吸光度值，以 1 mL 水代替 1 mL 酶液为对照。
如 160 W 时的酶活为(348±9) U/mL。
本实验酶活力单位定义为：在 40 ℃下，30 min
内水解 1 mg 淀粉（配制成水溶液，质量分数为 2.0%）
所需的酶量为一个酶活力单位（U）。
α-淀粉酶酶活的计算如公式（1）所示：
R  R

酶活力/(U/mL)= 0  50 D （1）
R 0
式中：50 为反应系数；R 0 、R 分别表示对照和反应
R  R
液的吸光度；D 为酶液的稀释倍数，调整 D 使 0
R 0
在 0.2~0.7 之间。