Page 132 - 《精细化工》2022年第1期

·122· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 39 卷

红色酵母菌采用分批补料发酵的方式发酵生产 IAA， 1.3 培养基
其 IAA 产量达到了 1627.10 mg/L。与化学合成法相 LB 液体培养基（g/L）：蛋白胨 10.0、酵母浸
比，采用微生物发酵法生产 IAA 具有过程条件温和、 粉 5.0、NaCl 10.0, pH 调至 7.0~7.2。
能耗低，不使用有毒有害物质，环境污染小等优点。 LB 固体培养基（g/L）：琼脂 20.0，其余同 LB
除植物能产生少量 IAA 外，许多微生物也能够 液体培养基。
[6]
产生 IAA。刘璐等 从大连市郊区农田的植物根际 发酵培养基（g/L）：葡萄糖 10.0、蛋白胨 10.0、
土壤中筛选出了一株芽孢杆菌，其 IAA 产量为 色氨酸 2.0、硫酸镁 1.5、磷酸氢二钾 1.5，pH 调至
[7]
106.11 mg/L。周铭典等 从猪粪堆肥中筛选出一株 7.0~7.2。
停滞帮杆菌（Corynebacterium stationis），其 IAA 1.4 方法
[8]
产量为 138.87 mg/L。GARG 等 从印度三叶草根瘤 1.4.1 高产 IAA 菌株的筛选
中分离出一株根瘤菌 BH14，其 IAA 产量为 176 mg/L。 （1） 菌株的分离：称取土壤样品 10 g，加入 100 mL
[9]
GHOSH 等 从大豆根系土壤中筛选出了一株肠杆 无菌水，28 ℃、120 r/min 振荡 30 min，静置 10 min，
菌，其 IAA 产量为 545 mg/L。细菌具有培养基简单、 形成 0.10 kg/L 菌悬液。将此土壤菌悬液用无菌水梯
生长速度快、发酵周期短、易规模化生产的特点。 度稀释成 1×10 ~1×10 ，然后将 1×10 ~1×10 –8
–3
–9
–5
但目前从土壤及其他来源筛选出的产 IAA 细菌普遍 稀释度的菌悬液涂布于 LB 固体培养基上，放置于
产量很低，难以满足发酵法工业化规模生产 IAA 的 30 ℃生化培养箱培养 48 h。挑取不同形态的菌落，
要求。此外，关于发酵法生产 IAA 的研究在国内外 并通过划线分离纯化得到单菌落。制成单菌落的 LB
开展得很少。 固体培养基（斜面），4 ℃冰箱保存。
本研究从蔬菜根际土壤中筛选出一株高产 IAA （2）IAA 产生菌的初筛：将斜面保藏的菌体用
的细菌菌株，经过鉴定，该菌株为霍氏肠杆菌。研 LB 固体培养基重新活化，然后用接种环挑取 2~3
究了不同碳源、氮源、无机盐和色氨酸条件下该菌
环单菌落接种到 LB 液体培养基中，30 ℃、180 r/min
株产生 IAA 的发酵特性，以期为微生物发酵法生产
摇床振荡培养 24 h。吸取 2 mL 发酵液于试管中，加
IAA 提供理论及实验依据。
入 4 mL Salksowski 显色试剂（1 mL 0.5 mol/L FeCl 3
[10]
1 实验部分 溶液与 50 mL 质量分数 35% HClO 4 溶液的混合液） ，
在避光条件下 40 ℃水浴 30 min。颜色变红者表示该
1.1 土壤样品 菌株具有产生 IAA 能力，且红色越深表明 IAA 产量
土壤样品采集于河北省石家庄市藁城区杜村蔬 越高。
菜种植基地黄瓜、番茄等蔬菜根际土壤，取样深度 （3）IAA 产生菌的复筛：将能够产生 IAA 的菌
为 0~20 cm。采集土样时剔除石块等杂物，放置无 株接种到发酵培养基中，接种体积分数 5%，30 ℃、
菌袋中，置于冰箱 4 ℃保存。 180 r/min 摇床振荡培养 24 h。发酵结束后，测定发
1.2 试剂与仪器 酵液中 IAA 的含量。
吲哚乙酸标准品，LC，北京索莱宝生物科技有 1.4.2 IAA 产生菌的鉴定
限公司；色氨酸，AR，上海罗恩试剂有限公司；糖 （1）产生菌的形态学及生理生化鉴定：参照《常
蜜，BR，南宁糖蜜糖业有限公司；棉籽粉、豆粕粉、 见细菌系统鉴定手册》，观察菌种在 LB 固体培养
花生饼粉，BR，北京鸿润宝顺科技股份有限公司； 基培养 24 h 后的形态特征，包括形态、颜色、边缘、
玉米浆，BR，河南鑫洋实业有限责任公司；淀粉、 表面、透明度等；对菌株进行革兰氏染色并用油镜
糊精、酵母浸粉、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、蛋白胨， 进行观察以确定菌种类型。对其进行氧化酶实验、
BR，北京奥博星生物技术有限责任公司；NH 4 Cl、 吲哚利用、柠檬酸盐利用、丙二酸盐利用、麦芽糖
(NH 4 ) 2 SO 4 、NaCl、NaNO 3 、KCl、MgCl 2 、CaCO 3 、 利用、D-山梨醇利用、MR（甲基红）实验和 VP（乙
CaCl 2 、MgSO 4 、K 2 HPO 4 、HClO 4 、FeCl 3 、甘油， 酰甲基甲醇）实验。
AR，天津市永大化学试剂有限公司。 （2）产生菌的分子生物学鉴定：分离纯化的菌
ZWY-240 恒温摇床，上海智城分析仪器制造有 株采用 SDS-CTAB（十二烷基磺酸钠-十六烷基三甲
限公司；HANNA pH211 台式酸度计，意大利哈纳 基溴化铵）法提取基因组，使用细菌通用引物 27f
仪器公司；EL204 型分析天平，梅特勒-托利多（上 (5 ′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1492r (5′-
海）仪器有限公司；752 型紫外-可见分光光度计， CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)对菌株序列进行
上海光谱仪器有限公司；SPX-250B-Ⅱ生化培养箱， 扩增 ，委托上海派森诺生物科技股份有限公司进行
[6]
上海贺德实验设备有限公司。 16S rDNA 鉴定。