Page 133 - 《精细化工》2022年第1期
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第 1 期                    徐科玉，等:  高产吲哚乙酸菌株的筛选、鉴定及其发酵特性                                    ·123·


            1.4.3  IAA 产生菌发酵产 IAA 特性研究                         到 274.32 mg/L；其次是菌株 FX-39，而菌株 FX-04
                （1）碳源对 FX-02 菌体生长及产 IAA 的影响实验                  产 IAA 能力最低，其 IAA 产量仅为 25.35 mg/L。因
                 将发酵培养基中碳源分别调整为葡萄糖、蔗糖、                         此，将菌株 FX-02 作为后续研究的对象。
            麦芽糖、淀粉、糖蜜、糊精和甘油，其质量浓度均
                                                                     表 1   筛选出的产 IAA 菌株的 IAA 产量
            为 10.0 g/L。培养基灭菌后，接入体积分数 5% FX-02
                                                               Table 1    IAA production of screened producing IAA strains
            种子液，30  ℃、180 r/min 摇床振荡培养 72 h。
                                                                        菌株                 IAA 产量/(mg/L)
                （2）氮源对 FX-02 菌体生长及产 IAA 的影响实验                          FX-02                274.32±3.20
                 将发酵培养基中碳源调整为甘油，氮源分别调                                  FX-04                 25.35±0.30
            整为氯化铵、硫酸铵、花生饼粉、豆粕粉、棉籽粉、                                    FX-18                 64.72±0.41
            酵母浸粉、玉米浆和蛋白胨，其质量浓度均为10.0 g/L。                              FX-39                194.74±1.70
                                                                       FX-72                100.15±1.20
            培养基灭菌后，接入体积分数 5% FX-02 种子液，

            30  ℃、180 r/min  摇床振荡培养 72 h。                      2.1.2   菌株鉴定
                （3）无机盐对 FX-02 菌体生长及产 IAA 的影响                      （1）形态学及生理生化特征鉴定：菌株 FX-02
            实验                                                 在 LB 固体培养基形成的菌落为圆形，呈乳白色，
                 将发酵培养基中无机盐分别调整为氯化钙、碳                          表面光滑、湿润、较透明（见图 1a）。在显微镜下
            酸钙、氯化钠、硝酸钠、氯化钾、氯化镁和硫酸镁，                            观察，菌株 FX-02 菌体呈短杆状（图 1b）。菌株
            其质量浓度均为 1.5 g/L，并将硫酸镁设为对照。培                        FX-02 的部分生理生化指标见表 2。
            养基灭菌后，接入体积分数 5% FX-02 种子液，30  ℃、
            180 r/min 摇床振荡培养 72 h。
                （4）色氨酸对 FX-02 菌体生长及产 IAA 的影响
            实验
                 将发酵培养基中色氨酸质量浓度分别调整为 0.1、
            0.3、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 和 12.0 g/L，
            其他成分及质量浓度保持不变，不添加色氨酸的培
            养基作为对照。培养基灭菌后，接入体积分数 5%                             图 1   菌株 FX-02 的菌落形态（a）和菌体形态（b）
            FX-02 种子液，30  ℃、180 r/min 摇床振荡培养 72 h。             Fig. 1    Colony morphology (a) and morphological feature
                                                                     (b) of strain FX-02
            1.4.4   分析方法
                 （1）菌体生长的检测：将发酵液直接或做适当                                   表 2   菌株 FX-02 生理生化指标
            稀释后，使用紫外-可见分光光度计测定发酵液在                             Table 2  Physiological and biochemical properties of strain
                                                                      FX-02
            600 nm 处的光密度值（OD 600 ）。                                    鉴定指标                     结果
                 （2）IAA 浓度的检测：参考 DEFEZ 等          [11] 的 IAA          革兰氏染色                     －
            浓度检测方法。发酵液 5000 r/min 离心 10 min，吸                         吲哚                        ＋
            取 2.0 mL 上清液与 2.0 mL 的 Salksowski 显色试剂                    氧化酶                       －
            混合，40  ℃避光水浴 30 min，使用紫外-可见分光                             丙二酸盐                      ＋
            光度计于波长 530 nm 处测定其吸光度。对照标准关                               柠檬酸盐                      ＋
                                                                      麦芽糖                       ＋
            系曲线计算单位体积发酵液中 IAA 产量。标准关系
                                                                      D-山梨醇                     －
            曲线通过梯度稀释 IAA 标准品绘制。
                                                                      MR 实验                     －
                                                                      VP 实验                     ＋
            2   结果与讨论
                                                                   注：“＋”表示阳性反应，“－”表示阴性反应。

            2.1   高产 IAA 菌株的筛选与鉴定                                  （2）分子生物学鉴定：以菌株 FX-02 的 DNA
            2.1.1   菌株筛选                                       为模板获得 1.4 kb（即千碱基对）的特异性 DNA 片
                 从蔬菜根际土壤中共分离出 135 株细菌。利用                       段。经 16S rDNA 测序获得菌株 FX-02 的 16S rDNA
            IAA 与 Salksowski 试剂的显色反应，初步筛选出具                    序列，并进行 NCBI 数据库 BLAST 序列比对，发现
            有明显颜色变化的菌株 5 株，其编号分别为 FX-02、                       FX-02 与霍氏肠杆菌 10-17（Enterobacter hormaechei
            FX-04、FX-18、FX-39、FX-72。对上述菌株进行复                   subsp. xiangfangensis  10-17）的一致性达到 99.65%。
            筛，定量测定其 IAA 产量，结果见表 1。如表 1 所                       根据比对结果，对 FX-02  与参比菌株构建系统发育
            示，菌株 FX-02 的产 IAA 能力最高，其 IAA 产量达                   树（图 2）。如图 2 所示，在进化树上菌株 FX-02
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