Page 120 - 《精细化工》2022年第6期
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·1186·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                 第 39 卷

            后，无菌条件下同时加入质量浓度为 2.5 g/L 的底物                       并与单水相体系（空白）进行对比，结果见图 1。
            肉桂醇和一定量有机溶剂（如油酸），在设定条件                                 由图 1 可看出，Sphingomonas sp. Z45 菌体的生
            （有机溶剂、油水两相体积比、转化温度、初始 pH、                          物量在油酸和水相构建的两相转化体系中达到 19.8
            底物质量浓度）下摇床反应 12 h。                                 g/L，高于在其他有机溶剂和水相构建的两相体系中
            1.5   菌体生物量的测定                                     的生物量，表明油酸对 Sphingomonas sp. Z45 菌体
                 转化结束后，取一定量转化液，用蒸馏水稀释                          的生物相容性更好。经实验计算，肉桂醇和 2-PE 在
            成合适倍数后，测定菌悬液在 600 nm 处的吸光值                         油相和水相中的分配系数分别为 0.4 和 8.3。结果表
            （OD 600 ）。根据 OD 600 （y）与菌体生物量（x，g/L）               明，肉桂醇有少部分溶解在油酸中，可以在转化初
            标准曲线方程 y = 0.7796x–0.3652 求出生物量          [16] 。    期减少反应物对细胞的毒害；同时油酸的加入有助
            1.6   转化产物的分析                                      于产物 2-PE 的原位移除，减少产物对细胞的毒害。
                 在转化液中加入等体积的无水乙醇，振荡摇匀，                         因此，油酸和水相构建的两相体系下，菌体生物量
            经 12000 r/min 离心 5 min，取上清液，用流动相稀                  （19.8 g/L）明显高于单水相体系（空白）相同条件
            释 20 倍，用 0.22 μm 有机滤膜过滤后，采用高效液                     下培养得到的菌体量（9.1 g/L）。
            相色谱仪对 2-PE 和肉桂醇进行定量分析                [17] 。根据文
            献[17]方法建立的标准曲线方程，计算出 2-PE 的质
            量浓度（g/L），并按式（1）计算肉桂醇的转化率。
                 肉桂醇转化率/%=(肉桂醇初始物质的量–肉桂
            醇剩余物质的量)/肉桂醇初始物质的量×100    （1）
            式中：物质的量单位均为 mol。
            1.7   分配系数的测定
                 在油酸相-水相两相体系中转化反应结束后，取
            10 mL 反应液，经 12000 r/min 离心 5 min，分别取
            1 mL 油酸相和水相液体，用甲醇稀释 10 倍，经

            0.22 μm 有机滤膜过滤后，用高效液相色谱法                  [17] 测         图 1   有机溶剂/水两相体系对转化的影响
            定肉桂醇和 2-PE 分别在油相（C油酸）和水相（C水）                       Fig. 1    Effect of organic solvents/water on transformation
            中的含量（g/L），按式（2）分别计算肉桂醇和 2-PE
            在两相中的分配系数（K）             [15] 。                        在油酸和水相两相体系中，随着转化反应的进
                                                               行，油酸中肉桂醇逐渐转移到水相参与反应，使肉
                                                      （2）
                               K=C油酸/C水
                                                               桂醇转化率（78.0%±2.5%）较单水相体系下的转化
            2    结果与讨论                                         率（60.2%±3.0%）提高。故选择油酸作为有机相构
                                                               建两相体系进行肉桂醇生物转化生成 2-PE 的研究。
            2.1   有机溶剂的选择                                      2.2   油相和水相体积比对转化的影响
                 选择合适的有机溶剂是进行两相体系生物转化                              在有机溶剂/水相两相体系中有机相的加入也
            的前提条件。在两相生物转化体系中，有机溶剂的                             会降低培养基的溶氧水平，溶氧水平不足会影响转
            选择主要考虑两方面：一是对生物催化剂的生物相                             化过程   [21] 。摇瓶转化中，培养基中溶氧水平受有机
            容性；二是对底物和产物合适的分配                  [18] 。有机溶剂       溶剂体积的影响，为此，考察了油相（油酸）和水
            在水中的溶解性与 logP（有机溶剂在标准水/正辛醇                         相（发酵培养基）体积比对 2-PE 转化合成的影响。
            体系中的分配系数的对数值）有很好的相关性，一                             在保持装液量为 20 mL 的基础上，加入油酸与发酵
            般 logP 值>4 的有机溶剂对生物催化剂活性无影响，                       液体积比分别为 1∶19、2∶18、5∶15、10∶10、
            是生物相容的       [19] 。实验参照已报道两相体系转化 L-                11∶9、12∶8、15∶5，其他条件同 2.1 节，考察两
            苯丙氨酸生成 2-PE 的相关研究           [14,20] ，选择了多种有        相体系中不同相体积比对最终发酵体系中菌体生长
            机溶剂与水相（即发酵培养基）构建两相体系转化                             和肉桂醇转化率的影响，结果见图 2。
            合成 2-PE。在保持装液量为 20 mL 的基础上，按体                          由图 2 可知，适当增加油酸的比例可减少肉桂
            积分数 10%（以装液量计）分别加入乙醚、正己烷、                          醇和 2-PE 对细胞的毒害，提高菌体生物量，同时缓
            油酸、甘油、石油醚和乙酸乙酯 6 种有机溶剂，在                           释肉桂醇，促进其转化。当 V(油相)∶V(水相)=10∶
            1.4 节（初始 pH=7）条件下，转化 12 h，考察了不                     10 时，菌体生物量最多，相对应的肉桂醇转化率也
            同有机溶剂对菌体生长和底物肉桂醇转化的影响，                             最高；再提高油水相比例（11∶9），菌体生物量和
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