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·1886·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                  第 35 卷

                                                  [1]
                 壳聚糖是一种天然的生物高分子多糖 ，相比                              柚皮苷（质量分数≥98%），宝鸡市方晟生物开
            一般高分子，生物高分子具有生物可降解、资源可                             发有限公司；壳聚糖（脱乙酰度 80%~95%，BR）、
            再生、生物相容性好、低免疫原性等特点                   [2-3] ，因此     硫酸亚铁（FeSO 4 ·7H 2 O，AR）、正硅酸四乙酯（TEOS，
            可广泛应用于食品、医药、环保等领域。壳聚糖是                             AR）、乙酸（AR）、吐温 80（CP）、氢氧化钠（NaOH，
            甲壳素的部分脱乙酰基产物，分子中含有丰富的羟                             AR），国药集团化学试剂有限公司；六水合三氯化
            基和氨基（分子结构见下式），因此在一定条件下可                            铁（FeCl 3 ·6H 2 O）、氨水（质量分数 25%）、柠檬酸
                                     [4]
            以发生一系列共价结合反应 。                                     三钠、无水乙醇、液体石蜡、石油醚、环氧氯丙烷、
                                                               硫代硫酸钠、柠檬酸、磷酸氢二钠、一缩二乙二醇，
                                                               AR，天津市大茂化学试剂厂；戊二醛（质量分数
                                                               50%），AR，天津市光复精细化工研究所；硼氢化
                                                               钠（NaBH 4 ），AR，天津市福晨化学试剂厂。
                 柚皮苷（Naringin）是一种双氢黄酮类化合物，
                                                                   PHS-3C 型 pH 计，上海仪电科学仪器股份有限
            具有一定的苦味，广泛存在于柑橘水果中，为避免
                                                               公司；SpectraMax Plus 384 型酶标仪，美谷分子仪
            果汁制品的不良口感，工业上主要采用柚苷酶进行                             器（上海）有限公司；JSM 7800F 型场发射扫描电
                     [5]
            脱苦处理 。同时，柚皮苷及其分解产物具有抗炎、
                                                               子显微镜，日本电子株式会社；Spectrum 10 傅里叶
            抗菌、抗癌和抗氧化等多种生物活性，因此在医药、                            变换红外光谱仪，美国 Perkin Elmer 公司。
                                                [5]
            化妆品和食品工业具有很大的发展前景 。柚苷酶
                                                               1.2   方法
            （Naringinase）是由 α-L-鼠李糖苷酶和 β-D-葡萄糖
                                                               1.2.1   柚苷酶酶液的制备       [13]
            苷酶组成的复合酶，其可将柚皮苷分两步水解：首
                                                                   将 4 ℃贮藏的黑曲霉 FFCC uv-11 转接到斜面培
            先，α-L-鼠李糖苷酶将柚皮苷水解为鼠李糖和普鲁
                                                               养基上，于 30 ℃恒温培养 96 h 得到成熟的孢子，
            宁，普鲁宁在 β-D-葡萄糖苷酶的作用下进一步被水
                                       [6]
            解为无苦味的柚皮素和葡萄糖 。与传统方法相比，                            再用质量分数为 0.9%的无菌生理盐水将孢子洗下，
                                                               测孢子悬液在 600 nm 下的吸光度值（OD 600 ），并用
            采用游离柚苷酶对柑橘果汁进行脱苦处理具有条件
                                              [5]
            温和、操作简单高效、无污染等特点 ，但也存在                             无菌生理盐水将其 OD 600 调至 0.200，接着将孢子悬
                                                               液以含量 10%（发酵培养基的体积为基准）的接种量
            稳定性差、无法回收再利用、纯酶制剂成本高等问
                                                               接种至 100 mL 的发酵培养基（250 mL 锥形瓶）内，
            题，限制了其工业化生产，因此研究者们对固定化
                                            [7]
            酶技术展开了广泛的研究。雷生姣 等用壳聚糖固                             在 30 ℃，180 r/min 条件下培养 5 d，得到的发酵液
                                              [8]
            定化柚苷酶，取得了一定效果；Awad 等用新型热                           用冷冻离心机在 4 ℃、6000 r/min 下离心 10 min，
            稳定生物高分子材料固定化柚苷酶，稳定性较好且                             上清液再经抽滤得到所需柚苷酶酶液，于 4 ℃冷藏
                                 [9]
            重复使用率较高；Xiao 等用磁性纳米颗粒固定化                           备用。
            柚苷酶，达到与底物快速分离的目的，但存在温度                             1.2.2   磁性硅基壳聚糖微球（MSC）的制备
            稳定性和耐酸性较差等问题。                                          利用化学共沉淀法和溶胶-凝胶法制得磁性硅
                 目前，常用的固定化材料如海藻酸钠和壳聚糖                          基纳米颗粒（MS）        [14] ，MSC 微球的制备流程如图 1
            等，需要依靠自然沉降实现固液分离，存在耐酸性                             所示。
            差、分离速度慢和分离不彻底等问题                 [7-9] 。为进一步           将 2.25 g FeCl 3 ·6H 2 O 和 1.61 g FeSO 4 ·7H 2 O 加
            提高固定化材料的耐酸性并实现固液快速分离，本                             入到盛有 100 mL 去离子水的三口瓶中，在通氮气的
                                        [10-12]
            文以 Fe 3 O 4 为核包裹一层 SiO 2        ，再包覆壳聚糖            条件下将体系温度加热至 85 ℃。在 1000 r/min 下搅
            得到具有活性基团的磁性硅基壳聚糖微球，并对磁                             拌并快速加入 10 mL 浓氨水，待溶液变黑后加入 153 mg
            性硅基壳聚糖微球固定化柚苷酶的催化、分离效果、                            的柠檬酸三钠，继续反应 30 min 后，产物用磁铁分
            重复利用性和储存稳定性进行了考察。本文工作为                             离，固相分别用去离子水和乙醇洗涤数次，获得柠
            进一步探索酶固定化技术提供了基础数据，同时对                             檬酸修饰的 Fe 3 O 4 纳米颗粒，干燥备用。然后，将
            推动柚苷酶的工业化进程具有重要意义。                                 0.1 g 柠檬酸修饰的 Fe 3 O 4 纳米颗粒均匀分散到含有

                                                               40 mL 无水乙醇、10 mL 去离子水和 1.2 mL 浓氨水
            1   实验部分
                                                               的混合液中，在 300 r/min 下逐滴加入分散在 30 mL
            1.1   主要材料与仪器                                      无水乙醇中的 TEOS（0.4 mL），室温反应 12 h。反
                 黑曲霉 FFCC uv-11，由大连工业大学菌种保藏                    应结束后，产物分别用无水乙醇和去离子水洗涤数
            中心提供。                                              次，获得磁性硅基纳米颗粒（MS），干燥备用。
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