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·1888·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                  第 35 卷

            1.2.4  MSCE 固定化柚苷酶水解柚皮苷的实验条件                       计算。
                   优化                                                      B/% = (A 0  – A 1 )/A 0 ×100   （2）
                 反应 pH 优化实验方法：取 40 mg 的 MSCE 固                 式中：B 代表载酶率，%；A 0 是指固定前酶液中的
            定化柚苷酶和 0.2 mL 游离柚苷酶，加入 0.8 mL 由                    总酶活力，U；A 1 是指固定后上清液中剩余的总酶
            缓冲液配制的 pH 分别为 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、                 活力，U。
            5.5 的柚皮苷溶液，50  ℃下进行酶解反应，测其相                            固定化柚苷酶的酶活回收率（R）按公式（3）
            对酶活力。                                              进行计算。
                 pH 稳定性实验方法：取 40 mg 的 MSCE 固定                              R /% = A 2 /(A 0  – A 1 )×100   （3）
            化柚苷酶，分别置于 pH 分别为 2.0、3.0、4.0、5.0、                  式中：R 代表酶活回收率，%；A 0 和 A 1 如公式（2）
            6.0、7.0、8.0、9.0 的缓冲液中，游离柚苷酶用缓冲                     所指；A 2 是指固定化柚苷酶表现的总酶活力，即酶
            液调至相应的 pH，同时在 4  ℃下保存 2 h，测其相                      解反应测得的总酶活力，U。
            对酶活力。                                              1.3   表征
                 反应温度优化实验方法：取 40 mg 的 MSCE 固                        分别用扫描电子显微镜（SEM）和红外光谱
            定化柚苷酶和 0.2 mL 游离柚苷酶，加入 0.8 mL 由
                                                               （FTIR）对磁性硅基壳聚糖微球（MSC）进行表征。
            pH 4.5 缓冲液配制的柚皮苷溶液，分别在 40、45、
            50、55、60、65、70  ℃下进行酶解反应，测其相对                      2   结果与讨论
            酶活力。
                 温度稳定性实验方法：取 40 mg MSCE 固定化                    2.1  MSC 的表征与性能分析
            柚苷酶和 0.2 mL 游离柚苷酶，分别置于 40 和 60 ℃                   2.1.1  SEM 表征
            恒温水浴中分别保存 0、2、4、6、8 h，测其相对酶                            MSC 的 SEM 图见图 3。由图 3a 可知，本文制
            活力。                                                备所得的 MSC 微球形状较规则，粒径约为 200 μm；
                 操作稳定性实验方法：在最适反应温度及 pH                         同时，由图 3b 可以看出，MSC 微球表面具有许多
            下，重复使用 MSCE 固定化柚苷酶（制备方法见 1.2.3                     微孔结构。微球呈球形、分布均一，尺寸小、比表
            节）进行水解柚皮苷实验，检测其活性的变化，以首                            面积大，且具有微孔结构，使该微球更容易对酶进
            次测定的酶活力为 100%，计算各相对酶活力。                            行固定化    [20] 。

                 贮藏稳定性实验方法：将 MSCE 固定化柚苷酶
            （制备方法见 1.2.3）和游离柚苷酶分别在 4 ℃下贮
            存 30 d，每 5 d 测一次酶活力，以贮藏前（第 0 d）
            的酶活力为 100%，计算各相对酶活力。
            1.2.5   柚苷酶酶活力的测定
                 采用改进的 Davis 法     [18] ：将 0.8  mL 0.8 g/L 由

            pH 4.5 缓冲液配制的柚皮苷溶液加入到含有 40 mg
                                                                         图 3  MSC 微球的扫描电镜图
            固定化柚苷酶（或 0.2 mL 游离柚苷酶）的反应体系
                                                                     Fig. 3    SEM images of MSC microspheres
            中，置于 50 ℃恒温水浴中反应 30 min，取 0.1 mL
            反应酶解液，加入含有 5 mL 一缩二乙二醇（体积分                         2.1.2  FTIR 表征
            数为 90%）和 0.1 mL NaOH 溶液（4 mol/L）的试管                    Fe 3 O 4 、MS 和 MSC 的 FTIR 结果如图 4 所示。
                                                                                               1
            中，混合均匀后静置 10 min，于 420 nm 处测定溶液                    图 4a 是 Fe 3O 4 的红外光谱图，568 cm 处对应 Fe—O
                                                                                        1
            的吸光度值。                                             的伸缩振动吸收峰，2920 cm 处的弱峰对应柠檬酸
                                                                                               1
                 柚苷酶酶活力（U）的定义：在 pH 4.5、50 ℃                    C—H 的伸缩振动吸收峰，3367 cm 处对应 O—H
            的条件下，每分钟降解 1 μg 柚皮苷所需的酶量为一                         的伸缩振动吸收峰        [10] 。图 4b 是磁性硅基纳米颗粒
                                                                                                   1
            个酶活力单位。酶比活力（U/g 或 U/mL）的定义：                        （MS）的红外光谱图，801 和 1092 cm 处分别对
            在 pH 4.5、50 ℃条件下，1 g 固定化柚苷酶（或 1 mL                 应 Si—O—Fe 和 Si—O 的伸缩振动吸收峰，是相对
            游离柚苷酶）所表现出的酶活力。相对酶活力按下                             于 Fe 3 O 4 红外光谱图新出现的峰，说明 SiO 2 通过化
            式计算。                                               学键成功包覆在 Fe 3 O 4 表面上      [10] 。在 MSC 的红外光
                                                                                              1
                 相对酶活力/% =  酶活力/最高酶活力×100 （1）                  谱图（图 4c）中，2925 和 2856 cm 处两个新增的
            1.2.6   固定化柚苷酶载酶率及酶活回收率的计算                 [19]    峰对应 MSC 微球表面 C—H 的伸缩振动吸收峰，
                 固定化柚苷酶的载酶率（B）按公式（2）进行                         1570 cm 1  处对应 N—H 的弯曲振动吸收峰，说明
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