Page 72 - 201812
P. 72

·2040·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                  第 35 卷

            环境污染较大，反应温度为 25 ℃，酶的温度耐受性                              引物 1：GGGGGATCCATGATTGATTTACGC
            以及可靠性较差；丙氨酸消旋酶在 50 ℃、pH=9.5 的                          AGTG
            条件下催化反应，条件较严苛，且转化率较低，二者                                引物 2：TGGGAATTCTTAACGCGCCAGGAAT
                                                                   GCACG
            均不适用于大规模工业化生产。因此，如何更加绿色、
                                                                   实验中所用培养基均为 LB 培养基。
            高效、经济地合成 L-4-硝基苯基丝氨酸至关重要。
                                                               1.2 方法
                 L-苏氨酸醛缩酶（EC 4.1.2.5, L-TA）是磷酸吡
                                                               1.2.1   基因工程菌[E. coli  BL21(DE3)/pGEX-KG-
            哆醛（PLP）依赖型酶，能够直接催化不同的醛与
                                                                     ltaE)构建
            甘氨酸进行 Aldol 缩合反应，形成不对称 C—C 键，
                                                               1.2.1.1   ltaE 基因克隆
            从而得到高附加值的 β-羟基-α-氨基酸，在生物合成                             以大肠杆菌 K-12 MG1655 基因组为模板，利用
            药物方面具有很大前景           [11-12] 。已有文献报道利用不
                                                               上述引物 PCR 扩增 ltaE。PCR 程序设定为：预变性：
            同微生物来源的苏氨酸醛缩酶催化合成丝氨酸以及                             94 ℃预变性 3 min；PCR 扩增过程：94 ℃变性 30 s，
            其衍生物     [13] 。Fesko [14-15] 等利用重组苏氨酸醛缩酶催          65 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，重复此过程 30 个
            化合成苯基丝氨酸，以及抗帕金森药物 L-苏式-3,4-                        循环；72 ℃延伸 10 min。
            二羟基苯基丝氨酸（L-DOPS）            [16] ，均获得较好的收
                                                               1.2.1.2   构建 pGEX-KG-ltaE 重组质粒
            率和立体选择性。近年来，苏氨酸醛缩酶晶体结构、                                将 PCR 扩增并纯化后的 ltaE 基因片段和载体
            功能特征和催化机制的研究不断深入                 [17-18] ，利用蛋白
                                                               pGEX-KG 分别用 BamHI 和 EcoRI 限制性内切酶双
            质工程对苏氨酸醛缩酶进行改造以得到更高转化率                             酶切，胶回收双酶切后的 ltaE 基因片段和 pGEX-KG
            和更广泛底物的酶         [19] ，然而利用重组 L-苏氨酸醛缩
                                                               线性化片段，用 T4 DNA 连接酶连接，获得重组质
            酶催化制备 L-4-硝基苯基丝氨酸的工艺却鲜有报道。
                                                               粒 pGEX-KG-ltaE。
                 本文通过基因工程手段重组表达了大肠杆菌来
                                                               1.2.1.3   重组 L-苏氨酸醛缩酶蛋白诱导表达
            源的低特异性 L-苏氨酸醛缩酶，以对硝基苯甲醛和
                                                                   将重组质粒 pGEX-KG-ltaE 通过热激法转化至
            甘氨酸为底物，全细胞催化合成 L-4-硝基苯基丝氨                          E. coli BL21（DE3）感受态细胞中，涂布于含氨苄
            酸，通过活性炭吸附柱分离转化产物                  [20] ，同时考察
                                                               抗性的 LB 平板上，37 ℃培养 12 h，筛选获得基因
            了 L-苏氨酸醛缩酶的酶学性质，优化了酶促反应条                           工程菌 BL21（DE3）/pGEX-KG-ltaE 菌落。挑选含
            件，旨在为绿色、高效合成 L-4-硝基苯基丝氨酸提
                                                               目的基因且测序正确的单菌落于含 50 mg/L 氨苄青
            供一种新思路。
                                                               霉素的 LB 平板上划线，37 ℃培养 12 h；然后接种
            1   实验部分                                           于 3 mL 含 50 mg/L 氨苄青霉素的 LB 培养基中，
                                                               37 ℃、200 r/min 摇床培养 12 h；将上述培养物按体积
            1.1   材料与仪器                                        分数 1%接种量接入含 50 mg/L 氨苄青霉素的 50 mL
            1.1.1   试剂与仪器                                      LB 培养基的 250 mL 三角瓶中，37 ℃、200 r/min
                 大肠杆菌表达宿主 E. coli BL21（DE3）菌株，                 摇床培养至 OD 600 为 0.5，加入终浓度为 0.3 mmol/L
            质粒 pGEX-KG 由本实验室保藏；聚合酶链式反应                         的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），30 ℃诱导 7 h。
            （PCR）引物，南京金斯瑞生物公司；pfu DNA 聚                        诱导结束后 4000 r/min 离心 15 min 收集菌体细胞，
            合酶、限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶，英国 New                       冷冻干燥，SDS-PAGE 分析重组蛋白表达。
            England Biolabs 公司；AP-MN-P-250 质粒提取试剂              1.2.2   酶活性测定方法
            盒、AP-GX-250 PCR 产物柱纯化试剂盒、AP-GX-250                     酶活性测定反应体系为：在 10 mL 0.2 mol/L 磷
            DNA 凝胶回收试剂盒，美国 Axygen 公司；对硝基                       酸缓冲液（pH=8.0）中加入 L-TA 全细胞 16 mg，
            苯甲醛，分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公                             0.2 mmol/L PLP，500 mmol/L 甘氨酸和 100 mmol/L
            司；其他试剂均为国产分析纯。                                     对硝基苯甲醛，45 ℃水浴振荡反应 24 h，利用 HPLC
                 MG48+型 PCR 仪，杭州朗基科学仪器有限公                      检测反应液中生成的 L-4-硝基苯基丝氨酸。酶活力
            司；THZ-C 恒温培养箱，上海跃进医疗器械一厂；                          单位（U）定义为：在上述反应条件下每分钟生成
            Waters e2695 型高效液相色谱仪，美国 Waters 公司。                1 μmol L-4-硝基苯基丝氨酸所需的酶量。
            1.1.2   菌种及培养基                                         HPLC 检测 L-4-硝基苯基丝氨酸。色谱条件              [22] ：
                 L-苏氨酸醛缩酶基因（ltaE）检索自 GenBank                   色谱柱: XBridge C18 柱（250 mm×4.6 mm× 5 μm）；
            （Gene ID: 944955），L-TA 基因工程菌由本实验室构                 流动相: V（CH 3 CN）∶V（50 mmol/L 磷酸二氢钾溶
            建，构建方法参考《分子克隆实验指南》                    [21] ，PCR    液）= 7∶93；检测波长: 270 nm；流速: 1 mL/min；
            所用引物序列如下（下划线部分为限制性酶切位点）：                           进样量: 20 μL；柱温: 25 ℃。
   67   68   69   70   71   72   73   74   75   76   77