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·2044· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 35 卷

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转化率的增长也逐渐减慢甚至不再增加。因此，从经 根据 HNMR 数据，并结合两种异构体的结构
[6]
济性角度考虑，选择适当的转化时间停止反应既可得 差异及文献 ，可推断出在本文中制备的 L-TA 酶催
到较高的收率，同时又能减少能源的消耗，所以本文 化下，两种异构体的比例为：n〔（2S,3R）-4-硝基苯
考察了反应时间对酶反应的影响如图 9 所示。 基丝氨酸〕∶n〔（2S,3S）-4-硝基苯基丝氨酸〕=2∶1。
1 HNMR（D 2 O, 600 MHz）数据可归属为：δ: 8.21 〔d,
J=8.76 Hz, 2H, (2S, 3R) 〕, 8.17 〔d, J=8.82 Hz, 2H,
(2S, 3S) 〕, 7.60〔d, J=8.64 Hz, 2H, (2S, 3R) 〕, 7.53
〔d, J=8.70 Hz, 2H, (2S, 3S) 〕, 5.38 (d, J=3.60 Hz,
1H, 〔2S, 3S) 〕, 5.32 〔d, J=4.26 Hz, 1H, (2S, 3R) 〕,
4.05 〔d, J=3.84 Hz, 1H, (2S, 3S) 〕, 3.87 〔d, J=4.44
Hz, 1H, (2S, 3R) 〕。

3 结论

针对化学法合成 L-4-硝基苯基丝氨酸需要强酸
图 9 反应时间对转化率的影响 和强碱的环境，反应需要有毒有机溶剂，环境污染
Fig. 9 Effect of reaction time on the enzymatic activities
较大的问题，在宿主细胞 E. coli BL21（DE3）中重
由图 9 可见，酶促反应随着时间延长底物转化 组表达大肠杆菌来源的 L-苏氨酸醛缩酶，以该酶为
率逐渐升高，反应进行到 24 h 后反应逐渐趋于平衡， 催化剂，甘氨酸和对硝基苯甲醛为底物能成功催化
4-硝基苯甲醛转化率达到 43%时不再增加，因此， 合成 L-4-硝基苯基丝氨酸，避免强酸、强碱和有毒
该酶促反应的最适转化时间为 24 h。 有机试剂的使用，反应条件温和。
2.5.4 L-4-硝基苯基丝氨酸的分离纯化 研究表明，在 45 ℃、pH=8.0，n（甘氨酸）∶n
分离纯化过程中吸附温度以及吸附介质的 pH （对硝基苯甲醛）=5∶1、甘氨酸浓度 500 mmol/L 的
对活性炭的吸附特性和效果均有影响。结合文献 条件下反应 24 h，目标产物 L-4-硝基苯基丝氨酸质量
[20]，以及实验摸索得出，在高温和低 pH （pH=3） 浓度达到 9.72 g/L，4-硝基苯甲醛转化率达到 43%。
条件下，活性炭对 L-4-硝基苯基丝氨酸的吸附量较 目前，虽然重组 L-苏氨酸醛缩酶对底物对硝基
低，对转化液中残余的全细胞和反应过程产生的少 苯甲醛的转化率有所提高，但离工业化应用还有一
量色素等有机杂质具有较高的吸附能力。同时，在 定距离。因此，利用蛋白质工程技术对 L-苏氨酸醛
较高 pH（pH=5）以及较低温度（25~30 ℃）条件下 缩酶进行定向进化，从而进一步提高 L-苏氨酸醛缩
对芳香族氨基酸具有很高的吸附能力，远高于对甘 酶的催化效率将是我们下一步研究的重点。
氨酸的吸附能力。因此，按照方法 1.2.4.5 节方法处
理酶转化液。洗脱分离时，先用蒸馏水洗脱，去除 参考文献：
甘氨酸和缓冲盐。再用体积分数为 50%的乙醇解吸 [1] Hua Yuxia (华玉夏), Jiao Xiaoyun (焦晓云), Liu Wenlu (刘文陆), et
al. Synthesis and asymmetric induction of chiral phase transfer
附目标产物，洗脱完全后，合并乙醇洗脱液，减压
catalysts I-(1S,2R)-(-)-(1-paranitrophenyl-1,3-dihydroxyl-2-propyl)
蒸馏，得到粗品，体积分数 50%的乙醇重结晶，乙 trimethylammonium iodide[J]. Chemical Reagents ( 化学试 剂 ),
醇洗涤，得到淡黄色结晶。 2003, 25(4): 201-202.
[2] Yang K, Wang Q, Su L, et al. Design and synthesis of novel
1.2.4.5 节反应体系中理论上可得到 L-4-硝基苯 chloramphenicol amine derivatives as potent aminopeptidase N
基丝氨酸 11.3 g，经过 HPLC 检测反应液中含有 (APN/CD13) inhibitors[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2009,
4.86 g 产物，因此，重组 L-TA 对底物的转化率为 17(11): 3810-3817.
[3] Alkhodir F, Refat M S. Synthesis, spectroscopic, thermal and
43%。反应液经过分离纯化后得到 L-4-硝基苯基丝 anticancer studies of metal-antibiotic chelations: Ca(II), Fe(III),
氨酸 3.96 g，此步骤收率为 81%，总收率为 35%。 Pd(II) and Au(III) chloramphenicol complexes[J]. Journal of
2.5.5 L-4-硝基苯基丝氨酸的鉴别 Molecular Structure, 2016, 1119: 157-166.
[4] Tetsuya Ichikawa S M, Younosuke A, Yoshiharu I. Synthetic studies
L-4-硝基苯基丝氨酸存在两个手性中心，L-TA of amino acids by the use of the copper complex.I. Syntheses of
催化合成的产物中 2 位手性中心保持 S 构型 （即 L β-hydroxy DL-amino acids by the use of the complex of copper(II)
with the Schiff base derived from glycine and pyruvic Acid[J].
构型），3 位的手性中心则包含 R 和 S 两种构型。因
Journal of the American Chemical Society, 1970,92(18): 5514-5516.
此，产物实际为（2S,3R）-4-硝基苯基丝氨酸与
（2S,3S）-4-硝基苯基丝氨酸两种异构体的混合物。 （下转第 2064 页）