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第 12 期 余进海，等: L-苏氨酸醛缩酶催化合成 L-4-硝基苯基丝氨酸 ·2041·

1.2.3 重组 L-苏氨酸醛缩酶酶学性质研究 甘氨酸和 100 mmol/L 对硝基苯甲醛，45 ℃水浴振
1.2.3.1 温度对酶活性的影响 荡反应，每隔 4 h 取样品，利用 HPLC 检测反应液
按照 1.2.2 节构建反应体系，在其他条件不变 中生成的 L-4-硝基苯基丝氨酸，考察反应时间对酶
时，分别在 30、35、40、45、50、55 和 60 ℃下进 反应的影响。
行反应，测定 L-TA 的酶活性，以各温度下的 L-TA 1.2.4.5 L-4-硝基苯基丝氨酸的分离纯化
相对酶活（酶活性与酶最大活性的百分比）对温度 在 500 mL pH=8.0 的磷酸缓冲液中加入 0.8 g 全
作图。 细胞、18.8 g 甘氨酸、7.6 g 对硝基苯甲醛，0.2 mmol/L
另将重组 L-TA，分别置于不同温度（40、45、 PLP，在 45 ℃水浴振荡反应，HPLC 检测产物不再
50、60 和 70 ℃）的水浴锅中温育，每隔 0.5 h 取出 生成时，离心去除全细胞及未反应的对硝基苯甲醛，
一份，3 h 后取毕，将取出的每一份酶按照 1.2.2 节 浓缩至 200 mL。调 pH= 3.0，加入 1 g 活性炭在 70 ℃
反应体系进行酶转化反应，检测各自的酶活性，以 水浴搅拌脱色 30 min，趁热过滤除去活性炭，转化
此测定酶的热稳定性。 液冷却至室温，调 pH=5.0，作为上柱液备用。
1.2.3.2 pH 对酶活性的影响 取 100 g 活性炭颗粒于 500 mL 的烧杯中，加入
按照 1.2.2 节构建反应体系，在其他条件不变时 上述反应液，充分搅拌，静置 15 min，湿法装柱。
分别在 pH=5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5 和 9.0 下测 用蒸馏水洗脱，去除溶液中未反应的甘氨酸。纸层
定 L-TA 的酶活性，以各 pH 条件下的 L-TA 相对酶 析检测，直至无甘氨酸流出，则甘氨酸冲洗完全。
活对 pH 作图，得出酶的最适作用 pH。 再用体积分数为 50%的乙醇洗脱产物，以 50 mL 为
另将重组 L-TA 置于不同 pH（6.0、7.0、8.0、 单位体积，收集产物洗脱液，纸层析检测洗脱终点。
8.5 和 9.0）的缓冲溶液中，45 ℃温育，每隔 0.5 h 合并洗脱液，浓缩得粗品，体积分数为 50%的乙醇
取出一份，3 h 后取毕，检测酶活性，将上述 pH 下
重结晶，乙醇洗涤后得淡黄色结晶。
温浴不同时间后的酶活性进行对比，以此探究重组
产物收率按下式计算：
L-TA 的 pH 稳定性。
收率/%= m/M×100
1.2.4 重组 L-苏氨酸醛缩酶在 L-4-硝基苯基丝氨酸
式中：m 为实际得到的产物质量，g；M 为理论产物
合成中的应用
质量，g。
1.2.4.1 催化反应路线
根据反应原理，在甘氨酸过量的情况下，产物的
L-苏氨酸醛缩酶催化合成 L-4-硝基苯基丝氨酸
理论物质的量与对硝基苯甲醛物质的量相等，因此：
的反应路线如下所示：
理论产物的质量(g)=L-4-硝基苯基丝氨酸的相对
分子质量(g/mol)×对硝基苯甲醛物质的量(mol)。

2 结果与讨论
重组 L-苏氨酸醛缩酶在辅酶 PLP 的协助下，催
化甘氨酸和对硝基苯甲醛合成 L-4-硝基苯基丝氨酸。 2.1 ltaE 基因克隆
1.2.4.2 底物物质的量比的影响 ltaE 基因克隆结果，如图 1 所示。
分别在 各 10 mL 0.2 mol/L 的磷 酸缓 冲 液
（pH=8.0）中加入 16 mg 全细胞，0.2 mmol/L PLP，
500 mmol/L 甘氨酸，以及与甘氨酸不同物质的量比
的对硝基苯甲醛，45 ℃水浴振荡反应 24 h，考察不
同底物物质的量比对反应的影响。
1.2.4.3 甘氨酸浓度的影响
在 10 mL 0.2 mol/L 的磷酸缓冲液（pH=8.0）中
加入 16 mg 全细胞，0.2 mmol/L PLP，再加入甘氨
酸，使其终浓度为 100、300、500、1000、1500 mol/L，
并各自按照 n（甘氨酸）∶n（对硝基苯甲醛）=5∶

1 的比例加入不同量的对硝基苯甲醛，45 ℃水浴振 M—D15000 Marker；a—ltaE PCR 产物；b—pGEX-KG 质粒单酶
荡反应，每隔 6 h 取样检测。 切产物；c—pGEX-KG-ltaE 单酶切产物；d—pGEX-KG-ltaE 双
1.2.4.4 反应时间的影响 酶切产物
图 1 ltaE PCR 产物和 pGEX-KG-ltaE 重组质粒酶切验证
在 10 mL 0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH=8.0）中含
Fig. 1 Identification of ltaE PCR product and the
L-TA 全细胞 16 mg，0.2 mmol/L PLP，500 mmol/L recombinant plasmid pGEX-KG-ltaE