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第 1 期                     商   峰，等:  玉米黄粉酶解液在发酵生产黄原胶中的应用                                   ·53·


            玉米黄粉）10 mL/g、酶添加量 2.5 kU/g、酶解温度                    产胶率的影响。玉米黄粉酶解条件为：碱性蛋白酶
            50  ℃和适宜酶解 pH（碱性蛋白酶 pH 为 8，中性蛋                     添加量 2.0 kU/g，其他条件同。
            白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶 pH                            1.3.3   可溶性蛋白测定
            为 7，酸性蛋白酶 pH 为 3）进行酶解反应。实验过                            采用总蛋白定量测试盒（BCA 法）测酶解液中
            程中添加 HCl 和 NaOH 稀溶液维持反应体系 pH 恒                     可溶性蛋白的含量        [19] 。
            定，酶解 4 h，调节酶解液 pH 为 7.0，沸水浴灭酶                      1.3.4   氨基酸态氮含量测定
                                                                                                          [20]
            15 min，5000 r/min 离心 15 min 去除固形物，水解                   参考 GB/T 5009.39—2003 测定氨基酸态氮含量 。
            物定容至 50 mL，获得 80 g/L 的玉米黄粉酶解液。                     1.3.5   氨基酸组成测定
            1.2.3   黄原胶的发酵制备                                       样品前处理：称取样品 20 mg，加入 6 mol/L 的
                 玉米黄粉酶解液按 10%（以黄原胶发酵体积为                        盐酸 10 mL，液体样品加入等体积的浓盐酸置于水
            基准，下同）的添加量添加到黄原胶发酵培养基中                             解管中，加入新蒸馏的苯酚 3 滴，向水解管中充入
            （玉米黄粉的质量浓度为 8 g/L），接种野油菜黄单                         高纯度 N 2 ，密封水解管，在（110±1） ℃下水解 22 h，
            胞菌种子液 5%（以培养基体积为基准，下同），在                           取出冷却，将水解液定容到 50 mL 待测。按照赵英
            28  ℃、220 r/min 下，发酵 72 h。发酵结束后，采用                 莲 [21] 等的方法，采用 2，4-二硝基氟苯柱前衍生
            酒精沉淀法制备黄原胶           [17-18] ，检测其黏度和产胶率。           HPLC，检测水解液中的氨基酸组成。
                 空白组为未经蛋白酶水解的玉米黄粉直接应用
            于黄原胶发酵培养基；对照组是将玉米黄粉酶解液                                         表 1   不同复配比例的氮源
                                                                Table 1    Different mixed proportions of nitrogen sources
            替换为大豆蛋白粉，大豆蛋白粉的质量浓度为 8 g/L，
                                                               m(玉米黄    玉米黄粉           m(玉米黄  玉米黄粉
            其他实验方法同上。                                                            大豆                     大豆
                                                               粉)∶m(大    酶解液/         粉)∶m(大  酶解液/
            1.3    测试                                           豆蛋白)      mL    蛋白/g   豆蛋白)      mL    蛋白/g
            1.3.1   蛋白酶活力测定                                      0∶10      0      4.0   5∶5      25      2.0
                 蛋白酶活力定义为 1 g 固体酶粉（或 1 mL 液体                     2∶8      10      3.2   6∶4      30      1.6
            酶），在一定温度和 pH 条件下，1 min 水解酪蛋白                         3∶7      15      2.8   7∶3      35      1.2
            产生 1 μg 酪氨酸，即为 1 个酶活力单位。按照 GB/T                      4∶6      20      2.4

            23527—2009 中的方法，分别测定了碱性蛋白酶
                                                               1.3.6   数据处理与分析
            Alcase 2.4L  FG（50  ℃、pH 8.0）、中性蛋白酶
                                                                   所有实验均重复 3 次，数据采用 SPSS17.0 进行
            NEUTRASE 0.8 L（50  ℃、pH 7.0）、风味蛋白酶
                                                               数据处理分析，标注相同字母的数据表示组内无显
            （50 ℃、pH 7.0）、复合蛋白酶（50  ℃、pH 7.0）、
                                                               著性差异（P>0.05），否则有显著性差异（P<0.05）。
            木瓜蛋白酶（50  ℃、pH 7.0）和酸性蛋白酶（50  ℃、
                                                               所有图均用 Origin 8.0 制作。
            pH 3.0）的酶活力。
            1.3.2   黄原胶黏度和产胶率的测定                               2    结果与讨论
                 黄原胶黏度测定：DV-Ⅱ+Pro 型黏度计，使用
            不同型号转子，转速 60 r/min 下测量黄原胶黏度。                       2.1    各种蛋白酶的酶活力测定
                 黄原胶产胶率测定        [17] ：将发酵得到的黄原胶采                  不同蛋白酶的酶切位点及酶解产物不尽相同，
            用精密天平称重，黄原胶质量与发酵液体积的比值                             确定蛋白酶活力，将为后续研究不同蛋白酶酶解液
            即为产胶率（g/L）。                                        对发酵黄原胶黏度和产胶率的影响提供指导。多种
                 按表 1 复配氮源，定容至 50 mL，考察了玉米                     蛋白酶活力结果如表 2，其中复合蛋白酶活力最高，
            黄粉酶解液与大豆蛋白质量比对发酵黄原胶黏度和                             达到 111.2 kU/g，碱性蛋白酶活力次之，为 107.8 kU/g。

                                                 表 2   各种蛋白酶活力的测定
                                       Table 2    Enzymatic activity assay of various proteases
                                                               蛋白酶种类

                             碱性蛋白酶         中性蛋白酶        木瓜蛋白酶         风味蛋白酶         复合蛋白酶         酸性蛋白酶
                 酶活力         107.8 kU/g    91.5 kU/mL    43.1 kU/g     21.0 kU/g    111.2 kU/g    30.3 kU/mL

            2.2    水解玉米黄粉蛋白酶的筛选及其对发酵黄原                         过蛋白酶水解玉米黄粉后，将酶解液添加到黄原胶
                 胶黏度和产胶率的影响                                    发酵培养基中更容易被微生物吸收利用，可以提高
                                                                       [9]
                 玉米黄粉富含疏水性氨基酸，水溶性差                  [16] 。通    其利用率 。按照 1.2.2、1.2.3 节中的方法制备玉米
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