Page 92 - 精细化工2019年第12期
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·2420·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                  第 36 卷

            无水乙醇，充分溶解后 4  ℃保存备用。                               1.2.4    16α 羟基化酶过氧化物分流反应条件优化
                 缓冲液 A：50  mmol/L  Na 2 HPO 4 ，5  mmol/L 乙         取 2  mL 浓缩酶液用于 16α 羟基化酶催化的过
            二胺四乙酸（EDTA），10 mmol/L 咪唑，0.1 mmol/L                氧化氢反应条件的优化：分别考察 1 mmol/L NaIO 4
            二硫苏糖醇（DTT），10%（体积分数）甘油，pH 7.2。                     和 H 2 O 2 这两种过氧化物对转化的影响；不同溶剂和
                 缓冲液 B：0.1 mol/L Na 3 PO 4 ，5 mmol/L EDTA，     助溶剂对泼尼松龙溶解度的影响；0~40 mmol/L Na                +
                                                                   +
            0.25 mmol/L DTT，10%（体积分数）甘油，pH 7.2。                和 K 对转化的影响；不同反应温度（15~50  ℃）、
            1.2   方法                                           反应 pH（6.0~9.0）、H 2 O 2 浓度（0.5~7.0  mmol/L）
            1.2.1    菌株培养                                      以及泼尼松龙浓度对过氧化物分流反应的影响。
                 取生长良好的 Streptomyces roseochromogenes          1.2.5    HPLC 检测分析
            SIIA-1902 斜面菌种，挖块接种于 25  mL 种子培养                       样品制备：取 1 mL 反应液，加入 1 mL 乙酸乙
            基中，30  ℃、220 r/min 培养 48 h，按体积分数 1%                酯结束反应并萃取，离心取 100 μL 乙酸乙酯相，挥
            接种量接种至发酵培养基，再加入 500 mg/L 泼尼松                       发后加入 100 μL 无水乙醇用于 HPLC 检测分析。
            龙溶液，30  ℃、220 r/min 振摇培养 72 h。                         HPLC 检测方法：Diamonsil C18 色谱柱（250 mm×
            1.2.2   Streptomyces roseochromogenes SIIA-1902 16α  4.6 mm，5 μm）；检测波长为 245 nm；流速 1.0 mL/min；
                   羟基化酶初步分离及浓缩                                 柱温：50  ℃；流动相为 V(乙腈)∶V(水)=3∶7，其
                 菌株培养结束后，4000  r/min 离心收集菌体，                   中含 0.1%（体积分数）甲酸；进样量 20 μL。
            用 pH  7.0 的 0.2  mol/L 磷酸缓冲液洗涤 2 次。取洗
            涤后菌体 25  g，重悬于 250  mL 缓冲液 A 中，冰浴                  2    结果与讨论
            下超声破碎至缓冲液澄清，4  ℃离心获得上清液，
                                                               2.1   菌株培养发酵及硫酸铵分级沉淀酶蛋白的过
            向上清液中逐渐加入 44 g 硫酸铵至 30%饱和度，加
                                                                   氧化物分流反应活性验证
            入过程中温和搅拌，并用体积分数为 10%的氨水控
                                                                   发酵 0  h 培养基中泼尼松龙的 HPLC 图谱检测
            制 pH 值为 7.2，静置过夜后 4  ℃离心收集蛋白沉淀，
                                                               结果如图 1a 所示。当 Streptomyces roseochromogenes
            按照硫酸铵分级沉淀饱和表继续加入硫酸铵分别获
                                                               SIIA-1902 发酵 48  h 后，发酵液中检测到有转化产
            得硫酸铵饱和度 30%~50%和 50%~70%时的酶蛋白
            沉淀。将各级饱和硫酸铵沉淀酶蛋白用 15 mL 缓冲                         物 16α-羟基泼尼松龙产生，如图 1b 所示。
            液 B 溶解，并在缓冲液 B 中用截留分子量为 30 kD                          收集培养 72 h 的玫瑰产色链霉菌在缓冲液 A 中
            的透析袋 4  ℃透析过夜，换液 3 次，透析后标定浓                        细胞破碎后，加入不同质量的硫酸铵对酶蛋白进行
            缩酶液至 20  mL，4  ℃保存用于 16α 羟基化酶催化                    沉淀，收集到 0~30%、30%~50%、50%~70%饱和硫
            过氧化物分流反应研究。                                        酸铵酶蛋白沉淀，分别用缓冲液 B 溶解后考察其在
            1.2.3    NaIO 4 支持下的 16α 羟基化酶催化过氧化物                NaIO 4 支持下 30  ℃反应 12  h 的反应活性。实验结
                   分流反应                                        果显示，30%~50%、50%~70%饱和硫酸铵蛋白沉淀
                 利用过氧化物分流反应测定 16α 羟基化酶的活                       无反应活性，如图 1c、图 1d 所示。0~30%饱和硫酸
            性。取 2 mL 浓缩酶液，加入 0.2 g/L 羟丙基环糊精、                   铵蛋白沉淀在 NaIO 4 支持下有 16α-羟基泼尼松龙的
            0.5 mmol/L 泼尼松龙，1.0 mmol/L NaIO 4 溶液，30  ℃         生成，如图 1e 所示，反应式如下。证实 16α 羟基化
            下 100 r/min 振摇反应 24 h。反应结束后进行 HPLC                 酶在 0~30%饱和硫酸铵沉淀中，且该酶具有过氧化
            分析。                                                物分流反应活性。
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