Page 91 - 精细化工2019年第12期
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第 12 期              吴   倩，等:  玫瑰产色链霉菌 P450 酶体外催化合成 16α-羟基泼尼松龙                           ·2419·


            霉菌属菌株已被广泛用于优良的类固醇羟化剂                      [1-3] 。   体外催化反应的成本。如 Niraula N P 等         [10] 利用细胞
                 目前，P450s 酶催化单加氧反应的机制有两种：                      色素 P450s  CYP107AJ1 在 H 2 O 2 作用下催化 7-乙氧
            氧还原活化途径以及过氧化物分流途径。大多数                              基 香豆素 脱烷 基化产 生新 的类似 物， 绕过 对
            P450s 酶催化活性依赖于复杂的电子传递伴侣系统                          NAD(P)H 和氧化还原配偶体的需求。然而，与正常的
            和 NAD(P)H，其活性中心亚铁红素传递电子激活分                         NAD(P)H 依赖性活性相比，由过氧化物分流途径驱
            子氧，从而完成底物的氧化。由于电子传递链组分                             动的催化效率通常低于氧还原途径。
            的复杂性和不稳定性，P450s 酶催化单加氧反应往                              本课题组前期研究发现，玫瑰产色链霉菌
            往利用完整的微生物细胞作为生物催化剂，这有利                             （Streptomyces roseochromogenes）SIIA-1902 完整细
            于保持酶的稳定和 NAD(P)H 的再生。但同时存在一                        胞能够将甾体化合物泼尼松龙催化为 16α-羟基泼
            些缺陷，例如：需要较大规模的发酵罐系统，能耗                             尼松龙，该催化过程同甾体化合物不同 C 位点羟基
            高，胞内酶的多样性使得催化反应伴随着立体选择                             化反应一样，存在着催化时间长，副产物多以及分
            性低和不良副反应；同时，在细胞本身的生长发酵                             离纯化复杂等问题。目前关于玫瑰产色链霉菌
            过程中会产生一些与生物催化反应无关的代谢副产                             P450s 中 16α 羟基化酶将泼尼松龙催化为 16α-羟基
            物，极大增加了下游分离纯化的难度，这些缺陷限                             泼尼松龙的报道都是基于完整细胞催化法                   [11] ，鲜见
                                                [4]
            制了完整细胞在生物催化反应中的应用 。                                关于 16α 羟基化酶的体外过氧化物分流反应活性报
                 少数天然 H 2 O 2 依赖的 P450s 酶只能利用过氧化               道。因此，本文针对前述玫瑰产色链霉菌 SIIA-1902
            物和氢过氧化物进入过氧化物分流途径发生单加氧                             完整细胞催化反应中的缺陷，探讨了该菌株 16α 羟
            反应，这类 P450s 被称为“过氧化酶 P450s”。过氧                     基化酶在体外是否具有对泼尼松龙的过氧化物分流
                                      [5]
            化物分流反应途径催化机理 如下式所示（以过氧                             反应活性，并对该体外反应体系的催化条件进行了
            化氢为例）。                                             优化。

                                                               1    实验部分

                                                               1.1   材料、试剂与仪器
                                                               1.1.1    试剂与仪器
                                                                   泼尼松龙，株洲森特生物科技有限公司；16α-
                                                               羟基泼尼松龙对照品，上海皋翔化工有限公司；酵
                                                               母浸粉，上海生工生物工程股份有限公司；麦芽浸
                                                               粉，北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖一

                                                               水合物、乙二胺四乙酸（EDTA）、(NH 4 ) 2 SO 4 、NaIO 4 、
                 首先，底物结合到 P450s 酶活性中心血红素铁                      羟丙基环糊精、丙三醇、甲醇、乙酸乙酯、乙醇，
            上，血红素铁直接与 H 2 O 2 反应，然后进行 O—O 键                    AR，成都市科隆化学品有限公司。
            的异裂，得到高反应活性中间体Ⅰ，再由化合物Ⅰ                                 Avanti  J-26XP 低温冷冻离心机，美国 Becman
            催化底物生成单加氧产物。由于该酶反应过程无需                             Coulter 公司；LC-10AS（SHIMADZU）型高效液相
            复杂的电子传递伴侣系统和 NAD(P)H，因此，可以                         色谱仪，日本岛津公司；JY 92-IIN 超声波细胞粉碎
            从完整细胞中分离粗酶或纯酶进行体外催化，得到                             机，宁波新芝生物科技股份有限公司。
            活性单加氧产物。与完整细胞催化相比，体外催化                             1.1.2    菌种及培养基
            法优点在于无需昂贵的发酵设备，反应时间短，副                                 Streptomyces roseochromogenes SIIA-1902，由四

            产物少，分离纯化过程简单。已报道的天然 H 2 O 2                        川抗菌素工业研究所菌种保藏中心保存。
            依赖的过氧化酶 P450s 具有严格的底物特异性，如                             斜面培养基：ISP 2 培养基（葡萄糖 4.0 g/L，酵
                                [6]
            P450 SPα （CYP152B1） 、P450 SCLA （CYP152A1）    [7]   母浸粉 4.0 g/L，麦芽浸粉 10.0 g/L，琼脂 20.0 g/L，
                                      [8]
            以及 P450 SBSβ （CYP152A2） 呈现出对脂肪酸的底                  pH 7.2±0.2）。
                               [9]
            物特异性；Bui P H 等 报道的人细胞色素 P450s2S1                       种子培养基：葡萄糖 4  g/L，酵母浸粉 4  g/L，
            呈现出对萘、苯乙烯、黄曲霉毒素 B1 等苯环类化                           麦芽浸粉 10 g/L，pH 7.0。
            合物的底物特异性。                                              发酵培养基：葡萄糖 12 g/L，酵母浸粉 6 g/L，
                 另外，有报道指出，部分利用氧还原活化途径                          麦芽浸粉 30 g/L，pH 7.0。
            的 P450s 酶可以体外构建过氧化物分流反应，用廉                         1.1.3    溶液配制
            价易得的 H 2 O 2 替代昂贵的辅酶因子，这大大降低了                          泼尼松龙溶液：取 0.5  g 泼尼松龙加入 25  mL
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