Page 95 - 精细化工2019年第12期

第 12 期 吴 倩，等: 玫瑰产色链霉菌 P450 酶体外催化合成 16α-羟基泼尼松龙 ·2423·

所示。玫瑰产色链霉菌 P450s 酶活性对 pH 变化非 24 h 的产物积累量，进一步研究了不同浓度泼尼松
常敏感，酶促反应最适 pH 为 7.2。pH 低于或高于 龙对转化率的影响，结果如图 10 所示。当泼尼松龙
7.2 时，酶催化活性都受到严重抑制。 浓度为 0.5 mmol/L、反应 24 h 时，16α-羟基泼尼松
龙产量为 64.3 mg/L，泼尼松龙转化率为 35.7%。泼
尼松龙浓度上升到 7.5 mmol/L 时，16α-羟基泼尼松
龙产量为 205.2 mg/L，泼尼松龙的转化率下降到
7.6%。

图 7 温度对过氧化物分流反应的影响
Fig. 7 Effect of temperature on the peroxide shunt reaction

图 9 过氧化氢浓度对过氧化物分流反应的影响
Fig. 9 Effect of H 2 O 2 concentration on the peroxide shunt
reaction

图 8 不同 pH 对过氧化物分流反应的影响
Fig. 8 Effect of pH on the peroxide shunt reaction

2.2.7 过氧化氢浓度对过氧化物分流反应的影响
过高的 H 2 O 2 浓度会对酶产生毒性从而抑制 16α

羟基化酶活性，考察了过氧化氢浓度对 16α 羟基化 图 10 泼尼松龙浓度对转化率的影响
酶过氧化物反应的影响，结果如图 9 所示。底物浓 Fig. 10 Effect of prednisolone concentration on the
度为 0.5 mmol/L 时，H 2 O 2 浓度在 0.5~1.5 mmol/L 范 conversion rate
3 结论
围变化时，泼尼松龙的转化率不断升高。当 H 2 O 2
浓度为 1.5 mmol/L 时，即 n(泼尼松龙)∶n(过氧化
氢)=1∶3 时，泼尼松龙的转化率达到最大值为 利用 H 2 O 2 代替天然的电子传递系统及辅酶
35.7%。之后，随着 H 2 O 2 浓度继续升高，泼尼松龙 NAD(P)H，建立了 P450s 酶在体外催化的缓冲液体
的转化率不断下降，显示出 H 2 O 2 对 16α 羟基化酶的 系，实现了泼尼松龙的体外 P450s 酶催化合成。研
抑制作用。 究表明，羟丙基环糊精的添加，有利于泼尼松龙溶
综上，16α 羟基化酶过氧化物反应最佳条件为： 解度的提高。当 0.5 mmol/L 泼尼松龙在反应缓冲液
缓冲液 pH 为 7.2，反应温度 30 ℃，n(泼尼松龙)∶ 体系为 50 mmol/L Na 2 HPO 4 、5 mmol/L EDTA、0.1
n(过氧化氢)=1∶3。 mmol/L DTT、10%（体积分数）甘油、pH 为 7.2，
2.2.8 不同底物浓度对转化率的影响 n(泼尼松龙)∶n(过氧化氢)=1∶3 时，30 ℃下反应
由于泼尼松龙在缓冲液中的溶解度不确定，且 24 h，16α-羟基泼尼松龙的产量为 64.3 mg/L，泼尼
高浓度的泼尼松龙对 P450s 酶有毒性。因此，在最 松龙的转化率为 35.7%。与完整细胞催化相比，酶
佳反应条件下〔羟丙基环糊精 0.2 g/L，底物浓度 体外催化法优势在于无需昂贵的发酵设备，且酶反
0.5~7.5 mmol/L，n(泼尼松龙)∶n(过氧化氢)=1∶ 3， 应的高效性将原本 7 d 的发酵时间大大缩短至 24 h。
缓冲液 pH 为 7.2，反应温度 30℃〕，检测 3、12、 有报道指出，利用外源性的引诱分子使 P450s