Page 98 - 精细化工2019年第12期
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·2426·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                  第 36 卷

                                      [4]
            的发展要求，应用前景很好 。微生物发酵或转化                             发酵培养基（g/L）：同种子培养基。
            所得的香精香料可视为“天然品”，在人们对天然产                                上述培养基均采用湿热灭菌，条件：灭菌锅蒸
                                          [5]
            品需求日益增加的今天备受推崇 。目前，国内外                             汽压力 0.105 MPa，121 ℃，20 min。
            已开展的微生物转化法生产天然 2-PE 研究，主要是以                        1.3    试剂与仪器
            L-苯丙氨酸为原料，利用酵母菌进行转化合成                     [6-10] 。     肉桂醇，AR，上海麦克林生化科技有限公司；
            Etschmann 等 [11] 利用马克斯克鲁维酵母在含 7 g/L 的              2-苯乙醇，AR，美国 Acros Organics 公司；葡萄糖、
            L-苯丙氨酸的合成培养基中，温度 35  ℃、发酵 41 h                     氯化钠、无水乙醇，AR，广东光华化学厂有限公司；
            后，得到 0.89 g/L 的 2-苯乙醇。Eshkol 等        [12] 筛选到     甲醇、乙腈，色谱纯，德国默克公司；冰醋酸，色
            一株能耐受 2-PE 质量浓度为 2.5  g/L 的酵母菌株                    谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。
            Ye9-612，该菌株在底物 L-苯丙氨酸质量浓度为 4                           Waters  e2695 高效液相色谱仪，美国 Waters 公
            g/L、温度 30  ℃、摇瓶培养 72 h 后，2-苯乙醇最终                   司；QP2010  UItra 气相色谱-质谱联用仪，日本
            产量为 0.85 g/L。唐育岐等       [13] 利用酵母 TYQ 在优化          Shimadzu 公司；Microfuge  22R 台式微量离心机，
            培养基（葡萄糖 80  g/L，L-苯丙氨酸 35  g/L，酵母                  德国 Beckman Coulter 公司；MQD-B3R 组合式振荡
            粉 10 g/L，蛋白胨 10 g/L）发酵 36 h 产 2-PE 质量浓             培养箱，上海旻泉仪器有限公司；PL2002 电子天平，
            度为 4.4025  g/L。崔志峰等      [14] 用紫外诱变等方法得            梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；Agilent 8453E
            到一株酿酒酵母 CWY132-10，经单水相分批补料发                        紫外可见分光光度计，美国安捷伦公司。
            酵得到的 2-苯乙醇达 3.6 g/L。梅建凤等            [15] 报道了酿      1.4    产 2-苯乙醇菌株的筛选
            酒酵母菌株经紫外诱变后产 2-苯乙醇提高到 5.40                         1.4.1    肉桂内生菌的分离与纯化
            g/L。以 L-苯丙氨酸为原料生产天然 2-苯乙醇，原                            无虫眼、斑痕的新鲜肉桂枝经表面消毒后，用
            材料成本相对较高。                                          无菌手术剪剪去肉桂枝被消毒液浸染的两端、去皮，
                 植物内生菌是一个多样性十分丰富的微生物类                          将其剪成 2 mm ×2 mm的小段后植入到富集培养基。
            群。由于内生菌长期生活在植物组织内部，这种独                             于 30 ℃恒温培养箱中倒置培养，待肉桂枝切面长出
            特的环境赋予内生菌独特的生物转化特性                    [16] 。目前，    菌落后及时挑取、分离至新的平板上。将平板划线
            对植物内生菌的生物转化研究主要集中在天然药物                             纯化得到的单菌落接种于斜面，在 30  ℃恒温培养
            生物转化     [17-19] 、立体选择性生物转化        [20] 、生物脱       箱中倒置培养 24 h，保存于 4  ℃冰箱。
            毒 [21-23] 以及生物质降解    [24-25] 等方面。香料植物内生            1.4.2    培养及转化
            菌在天然香料的合成制备中的应用开始得到人们的                                 将分离得到的肉桂内生菌斜面菌种经活化培养
            关注，但尚处于起步阶段            [26] 。                      后，挑 2~3 环菌体接入种子培养基，于 30  ℃、
                                                               200 r/min 的恒温振荡摇床中培养 12 h。按体积分数
                 肉桂醇是一种苯基香精香料，其价格较 L-苯丙
                                                               为 5%的接种量移取新鲜种子液到装有 20  mL 无菌
            氨酸便宜。本文以肉桂醇为原料，利用从新鲜肉桂
                                                               发酵培养基的 150 mL 三角瓶内，于温度为 30  ℃、
            枝中筛选出的一株植物内生菌 Sphingomonas sp.
                                                               转速为 200  r/min 的恒温振荡摇床内扩大培养 24  h
            Z45 生产天然 2-PE；采用 GC-MS 跟踪监测了反应
                                                               后，无菌条件下加入质量浓度为 2  g/L 的底物肉桂
            中间体，推测了其可能的代谢途径；优化了该菌株
                                                               醇，在相同条件下反应 24 h。
            生物转化肉桂醇合成天然 2-PE 的工艺条件；以期为
                                                               1.5    转化产物的分析
            利用香料植物内生菌制备天然香料 2-PE 探索了一
                                                               1.5.1    高效液相色谱分析
            条新途径。
                                                                   转化液加入等体积的无水乙醇，振荡摇匀，经
            1    实验部分                                          12000 r/min 离心 5 min，取上清液，稀释，用 0.22 μm
                                                               有机滤膜过滤后用于高效液相色谱仪分析。
            1.1    材料                                              色谱分析条件：色谱柱为 SunFire           TM C 18 色谱柱
                 新鲜野生肉桂枝，产自广西贵港。                               （250  mm×4.6  mm×5  μm）；柱温为（30±5）℃；流
            1.2    培养基                                         动相为 V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)∶V(冰醋酸)=28.4∶
                 富集培养基：LB 培养基；斜面培养基（g/L）：                      18∶53.6∶0.04；等梯度洗脱，流速为 1.0  mL/min；
            葡萄糖 20，蛋白胨 10，磷酸氢二钾 1，氯化钠 0.5，                     UV-VIS 检测器检测，检测波长为 204 nm；进样量为
            七水合硫酸镁 0.5，七水合硫酸亚铁 0.01，酵母粉                        10 μL。
            2.5，琼脂 20，pH = 7.0；种子培养基（g/L）：葡萄                   1.5.2    GC-MS 分析
            糖 30，蛋白胨 16，磷酸氢二钾 1，氯化钠 0.5，七                          转化液加入等体积的乙酸乙酯充分萃取后，于
            水合硫酸镁 0.5，七水合硫酸亚铁 0.01，pH = 7.0；                   旋转蒸发仪浓缩至 1~2 mL，用于 GC-MS 测定。
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