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·572·                             精细化工   FINE CHEMICALS                                  第 36 卷

            3.2    定向进化                                        平，提高了酵母菌的乙醇耐受性；随后，Yang                   [31] 等
                 定向进化又称适应性进化，是指微生物通过进                          用 gTME 方法又对 SPT15 进行随机诱变并获得了一
            化提高其适应新环境的能力，能够在较短的时间内                             株新的 SPT15 突变菌株，该菌株的产量和产率分别
            高效地改变菌株的某些生理特性（如细胞的生长速                             从 0.31 g/g 和 2.6 g/（L/h）提高为 0.39 g/g 和 3.2 g/
            度，对胁迫的耐受能力等）。由于目前依赖环境条件                            （ L/h），进而表明用全局转录方法对转录因子
            的自然选育技术逐渐失去了获得其天然样本的条                              SPT15 的定向进化，可使乙醇耐受性和乙醇产量大
            件，因此，利用环境条件诱导的传统适应性进化是                             幅提高。与此同时，国内赵心清               [32] 等通过对酿酒酵
            微生物耐受性研究的主要手段。如耿笑林                    [24] 等通过     母另一个全局转录调控因子 SPT3 进行易错 PCR，
            高温适应进化，得到了能够在 38  ℃正常生长的假                          并筛选在高浓度乙醇中耐受性提高的突变株，获得
            丝酵母，而且其在 38  ℃时的木糖醇生产能力接近                          了一株在体积分数为 10%乙醇中生长较好的突变
            其在 30  ℃时的生产能力；2016 年，Nielsen           [25] 课题    株。但由于部分转录因子的作用机理尚不清晰，而
            组也通过定向进化的方法，得到 40  ℃下生长的耐                          且微生物的遗传背景复杂且耐受性受多种机制调
            热酵母菌株；Satomura       [26] 等通过热激适应实验在重              控，并且实际工业中往往是多种胁迫因子共同存在，
                                                               因此单独对少数几个功能基因进行调控，不易获得
            构 CDC25 基因突变菌株后，获得了在 39  ℃下有效
                                                               较大幅度的耐受性，也难获得稳定性好的菌株。
            乙醇发酵菌株。从适应性进化方法近年来研究的持
                                                               3.5    理性育种技术
            续热度可见，其在选育耐受性微生物方面仍具有极
                                                                   后基因组时代的到来使得大量的基因功能被揭
            大的潜力及优势，然而其漫长的驯化过程及巨大的
                                                               秘，同时利用多组学分析揭示出的微生物耐受性机
            工作量使研究者们仍在积极探索新的方法和技术。
                                                               制及相关数据，有不少学者通过理性设计调控酿酒
            3.3    基因组改组技术
                                                               酵母自身的耐受基因使其具有抗逆性。如 Hiroyuki                 [33]
                 基因组改组技术（Genome shuffling）是一种建
                                                               和 Shahsavarani [34] 等均通过多个泛素结合酶与泛素
            立在传统诱变技术和细胞融合技术基础之上，对微
                                                               连接酶 Rsp5 的过表达，增强胞内蛋白质的泛素化，
            生物细胞进行基因组重组的体内分子育种新技术，
                                                               使酵母菌株对多种胁迫的耐受性均得到了提高；
            通过模拟自然进化的过程，将工程学原理与人工设
                                                               Qiu [35] 等通过过表达 GSH 快速清除热胁迫下的大量
            计相结合，使人们可以在较短的时间里得到性状改
                                                               氧自由基，提高了酿酒酵母高温下的鲁棒性，并且
            良的正向突变菌株，是目前工业微生物育种的先进
                                                               经 SSF 工艺其乙醇产量也提高为对照的两倍。以上
            技术。20 世纪 90 年代，美国加州 Maxgen 公司首次
                                                               方法均是利用酿酒酵母自身的耐受机制，然而自身
            提出了基因组改组技术并成功将此新技术应用于菌
            株表型的改良上；2012 年，Zheng            [27] 等通过基因组        的耐受机制仅限于菌株本身且提升的幅度有限，很
                                                               难达到真实物料中全局耐受的理想效果。此外，采
            改组技术既提高了菌株在发酵过程的热稳定性，又
            提高了谷氨酸棒状杆菌的谷氨酸产量；王灏                     [28] 等通    用合成生物学“自下而上”的工程化设计思想，通
                                                               过对多种异源微生物的耐受机制构建标准化的元器
            过基因组改组的方法将耐热和生产性能均较好的酵
                                                               件与模块，植入拟改造的微生物中实现其抗逆性的
            母菌进行两轮基因组改组技术，在 35  ℃相对高温
                                                               改造，也是目前理性改造微生物耐受性的新方法，
            条件下乙醇产量得到提高；Lu             [29] 等通过基因组改组
                                                                    [4]
                                                               如 Liu 等分别以腾冲嗜热菌中热激蛋白编码基因、
            技术获得具有乙酸和糠醛耐受性的重组菌株，且该
                                                               泛素蛋白编码基因及分子伴侣为功能元件，以酿酒
            菌株的耐高温性能也得到了大幅度的提高。由于该
                                                               酵母自身的强组成型启动子 FBA1p 为调控元件，构
            技术涉及多个不同优良性状细胞的融合，先不说操
                                                               建耐热元器件库转入酿酒酵母，其中分子伴侣
            作及筛选的繁琐性，单说同一种属多个不同方面性
                                                               GroESL 可以提高酿酒酵母耐热性并提高细胞的生
            状优良菌株的获得就限制了该法的广泛应用。
                                                               物合成效率。同样，针对微生物某一耐受机制的理
            3.4    全局转录机器工程
                                                               性设计在工业真实物料中结果往往并不显著，同时
                 全局转录机器工程（global transcription machinery
                                                               也并非所有的微生物特性都能通过理性的技术进行
            engineering，gTME）是基于易错 PCR 进行突变从
                                                               改造，缺乏一定的普适性。
            而改变用于调节基因整体转录的关键蛋白，使相关
            基因的转录由一个水平转换到一个新的水平。                               4    微生物多重耐受性的研究
            Alper [18] 和 Chen [30] 等应用 gTME，通过对酵母细胞
            存活必需的转录因子 SPT15 进行突变，从而改变了                             从传统的适应性进化到基于基因组分析的理性
            RNA 聚合酶的活性，改变细胞内多个基因的转录水                           育种技术，一般都存在着一种技术策略适用于一种
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