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第 4 期 王小艳，等: 淀粉质燃料乙醇发酵胁迫及菌株耐受性改造 ·573·

微生物，缺乏一定的普适性，且大部分研究是在实 乙醇发酵产业普遍采用间歇式发酵，使工业酿酒酵
验室模式微生物及组成培养基上进行，在很大程度 母失去了对发酵微环境长期适应性进化的机会，很
上脱离实际的工业环境，无法达到生存性能与生产 难从现有发酵菌株中获得遗传性状稳定的正向突变
性能的共同提高，很难实现工业生产的实际应用。 株，但从整个工艺降本增效的角度，淀粉质燃料乙
针对以上大部分顾此失彼的研究结果，有少部分研 醇发酵产业也是存在很大的菌株耐受性改造的需
究者也开始转向关注微生物的多重耐受性，如有研 求，而工业菌株的耐受性改造更应该立足于根本，
究者用全基因组易错 PCR 技术使乙醇耐受性从 6% 从实际工况环境出发，由本文开头分析的淀粉质燃
提高到 9%，同时在耐受 100 g/L 葡萄糖的条件下生 料乙醇发酵胁迫因子可见，酿酒酵母的发酵过程经
长良好 [36] ；Kitichantaropas [37] 等发现前期分离获得的 受着发酵微环境的多重胁迫，酵母响应不同胁迫环
3 株耐受多重胁迫的菌株表现出低的细胞内活性氧 境具有不同的耐受机制，且不同耐受机制间又存在
水平和有效细胞壁重塑系统；Thompson [38] 在研究木 错综复杂的交互关系，因此关注点不应该在强调微
质纤维素抑制物与耐性菌株发酵能力的过程中发 生物某一方面的耐受性，而应该转变到关注微生物
现，基因的进化与多抑制物具有协同作用，微生物 在特定环境下的多重耐受性亦或是全局耐受性上来。
抵抗多重胁迫因子的能力迫使其基因组发生变化， 当然，生物系统是一个自组装系统，经过长期
如果将其理解为基因组层面的突变可以使微生物获 的进化和选择，形成了一个“Robustness”的生物细
得多种耐受能力，这或许成为现代微生物育种技术 胞，使细胞各个元件能够协同作用，适应胁迫环境，
的一个研究方向；同时，近年新一代精准基因组编 并获得竞争优势，所以，微生物基因组系统内存在
辑技术 CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced 着强大的进化能力，可进行自主编辑，提升自身系
short palindromic repeats）研究十分火热，该系统已 统，从这个角度来看，基于环境条件诱导的传统适
成功应用于人类细胞、斑马鱼、果蝇、线虫、细菌、 应性进化技术在提高微生物耐受性上确实是十分有
拟南芥、酵母等生物的基因组定点修饰中 [39] ，基于 效的手段，但按照以往的研究仅针对某一胁迫条件
CRISPR/Cas9 精准的基因组编辑能力，科学家们开 的传统驯化技术存在耗时、低效、工作量大、稳定
发出了一个用于高通量全基因组筛选 sgRNA 的 性差等问题；事实上有效的传统适应性进化的过程
CRISPR/Cas9 数据库 [40] ，并且研究显示通过设计多 即为外界压力导致细胞内 DNA 双链断裂（Double
个不同 sgRNA，可以实现一次操作编辑多个基因 [41] ； strand break，DSB），在微生物非同源末端连接
为实现基因组更多位点的突变达到进化基因组目 （Non-homologous end-joining，NHEJ）和同源重组
的，Ryan [42] 建立了 multiplex CRISPR（或 CRISPRm） （Homologous recombination，HR）DNA 修复方式
的方法，利用靶向 sgRNA 剪切基因组并加入具有同 下引入、插入、缺失、突变，进而使细胞呈现多种
源臂的 DNA 文库后，基于酿酒酵母同源修复机制形 表型。基于以上原理，通过使基因组多重位点同步
成多样菌株突变库，进而筛选出使纤维二糖发酵率 突变，再结合高通量定向筛选的定向进化工程也是
提高十倍以上的突变菌株；此外，2018 年赵惠民老 近年来获得微生物耐受性的有效方法，如 Snoek [44]
师课题组通过建立酿酒酵母全基因组 sgRNA 文库， 等使用大规模机器人辅助的基因组重排技术，经靶
并结合酵母自身的 HDR 修复机制建立酵母突变菌 向性基因组重排得到了 3000 个突变株，进而筛选得
株库，利用全基因组进化方法〔CRISPR-Cas9-and 到 8 株发酵效果好于商业菌株的突变株；使用转录
homology-directed-repair (HDR)-assisted genome-scale 因子接收去核酸酶系统辅助多重编辑技术（TAME）
engineering, CHAnGE〕提高酵母对抑制因子的耐受 促使酵母基因组进化，在短时间内使酵母的乙醇耐
性 [43] 。以上研究结果显示，采用现代基因组编辑的 [3]
受性得到大幅提升 。目前这方面的技术大部分还
先进技术可在一定程度获得大量的突变菌株，如果
是针对转录因子或启动子区域等基因组上具有同源
再辅以特定环境的定向进化，可加速基因组的进化
性的靶向序列，但菌株多样性的表型往往并不局限
从而快速获得正向突变菌株，然而如何采用基因组 在体内某些功能蛋白表达水平的变化，而更多是
编辑技术实现全基因组多位点突变进而结合工业实 功能蛋白或调控区域的突变。因此，如能开发出全
际物料高通量地筛选优势突变菌株至关重要。
基因组任意位点的突变，加速实现基因组随机多重
5 结论与展望 位点同步自主编辑，并耦合工业发酵物料及发酵微
环境的选择压力推动基因组快速自主编辑，则可加
微生物对发酵微环境的适应性是其长期进化的 速菌株的适应性进化，进而获得与特定发酵环境匹
结果，也是细胞内决定其生化反应与代谢途径对发 配的多重耐受性菌株，切实为现代发酵工业获得高
酵微环境变化适应的综合表现。而目前淀粉质燃料 产、高效、高耐受性的工业发酵菌株。