Page 91 - 《精细化工》2020年第3期
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第 3 期                    贾   昊，等:  聚乳酸降解菌的分离鉴定及其产酶和降解特性                                  ·509·


            10.0；酵母提取物为 5.0；NaCl 为 10.0。pH 为                   37  ℃、转速为 130 r/min 恒温培养箱中培养 5 d 后，
            7.2~7.4。                                           采用福林酚法测上清液中蛋白酶活。在确定最佳外
                 脱脂奶粉培养基（g/L）：脱脂奶粉为 40.0；琼                     源碳源基础上，再分别加入质量分数为 1%的硫酸
            脂为 15.0。自然 pH。                                     铵、尿素、硝酸钾、胰蛋白胨、酵母提取物作为不
            1.4    PLA 降解菌的分离纯化                                同外源氮源，相同条件下培养 5  d 测上清液中蛋白
                 将土壤配制成不同浓度梯度的菌悬液，接种于                          酶活。
            筛选培养基中，在 37  ℃、130  r/min 的恒温培养箱                   1.8    培养条件单因素优化
            中培养数天。待微生物在平板表面出现菌落时，在                                 在 250 mL 锥形瓶中依次加入 100 mL 筛选培养
            平板上挑取单菌落再接种至筛选培养基上，经过多                             基、质量分数为 2%的葡萄糖和质量分数为 1%的胰
            次分离纯化、采用显微镜观察等方法逐步分离获得                             蛋白胨，即优化后的筛选培养基。基于此，依次单
            单一菌株。                                              一改变菌株的培养条件，改变 pH 为 5.1、6.1、7.1、
                 种子液的制备：挑取筛选培养基上的降解菌，                          8.1、9.1，接种 0.5  mL 的种子液，在 37  ℃、转速
            接种于 100 mL 的 LB 培养基中。将其置于摇床，在                      为 130 r/min 的恒温培养箱中培养 5 d，测上清液蛋
            37  ℃、转速 130 r/min 的条件下，培养 12 h，制备                 白酶活；在 pH 为 7.1 条件下，改变种子液接种量
            得到种子液。                                             为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5  mL，将其置于 37  ℃、
            1.5    菌株产蛋白酶活性测定                                  转速为 130 r/min 的培养箱中培养 5 d 后，测上清液
                 挑取筛选培养基上的单一菌落，接种至脱脂奶                          酶活；在 pH 为 7.1 及接种量为 1 mL 条件下，改变
            粉培养基，通过观察其有无水解圈，初步判断其产                             培养箱温度为 22、27、32、37、42  ℃，在转速为
            蛋白酶能力，选择水解圈大的降解菌 SD12 作为研                          130  r/min 的培养箱中培养 5  d，测上清液酶活，研
            究对象。蛋白酶活测定参照福林酚法                  [23] ，1 个单位      究培养条件对菌株产酶活性的影响。
            的蛋白酶活（U/mL）定义为在 40  ℃、pH 7.5 条件                    1.9   响应曲面法产酶培养条件优化
            下，1  mL 上清液中每分钟水解酪蛋白产生 1  μg 酪                         在单因素实验基础上，以蛋白酶活为响应值，
            氨酸的酶量。                                             选取 pH、接种量及温度三个因素，根据 Box-Behnken
            1.6   菌株鉴定                                         中心组合实验设计原理，采用响应曲面法对产酶培
                 形态学观察：在 LB 培养基上，观察菌落形态，                       养条件参数进行优化，获得最优发酵条件组成。实
            并用扫描电镜对菌株进行形态学观察。生理生化实                             验因素及水平见表 1，每组实验重复 3 次，结果取
            验：根据《常见细菌系统鉴定手册》进行                    [24] 。菌株     平均值。
            的 16S rRNA 基因序列分析：采用通用引物 27F（碱
                                                                             表 1    实验因素及水平
            基序列为 AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG）及 1492R
                                                                      Table 1    Experimental factors and levels
            （碱基序列为 AAG  GAGGTGATCCAAGCC）为总                                                  水平
            DNA 模板，进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。反应                               因素
                                                                                   –1        0        +1
            体系为：预混液 2×Taq PCR Master Mix 20 μL，引物
                                                                    A  （pH）        6.1      7.1       8.1
            27F/1492R（10.0 μmol/L）各 2 μL，总 DNA 为 3 μL，           B  （接种量）/mL       0.5      1.0       1.5
            补加 ddH 2 O 至 50 μL。PCR 扩增条件：94  ℃预变性                  C  （温度）/℃        27        32       37
            5  min，94  ℃变性 30  s，55  ℃退火 30  s，72  ℃延
            伸 5  min，30 个循环。将扩增产物送至生工生物工                       1.10    菌株对 PLA 降解特性研究
            程（上海）股份有限公司测序，将结果提交至                                   在 250 mL 锥形瓶中依次加入 100 mL 筛选培养
            GenBank 数据库并在 EzBioCloud 数据库进行 Blast               基、质量分数为 2%的葡萄糖、质量分数为 1%的胰
            比对，然后用 MEGA  7.0 软件邻接法聚类构建系统                       蛋白胨和 1 块 PLA 膜，并调节 pH 至 7.4。在此培养
            发育树。                                               基中，接种 1.4  mL 的种子液，考察了菌株对 PLA
            1.7    外源营养源对微生物产酶影响                               的降解作用；同时设置不接种降解菌作为对照组，
                 在 250  mL 的锥形瓶中加入 100  mL 筛选培养                以考察 PLA 水解对菌株降解情况的影响。每组 3 个
            基，考察了不同外源碳源对菌株产酶的影响，在各                             平行样，将其置于摇床中，在 32  ℃和 130 r/min 的
            个筛选培养基中分别加入质量分数为 2%的乳酸、对                           条件下培养数天，每隔 24 h 计算 PLA 膜的质量损失
            苯二甲酸、丁二醇、己二酸、葡萄糖、淀粉及蔗糖。                            率并测培养液的 pH。
            调 pH 至 7.1、接种种子液 0.5 mL，置于摇床中，在                        扫描电镜（SEM）测试：将降解前后的 PLA 膜
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