Page 160 - 《精细化工》2020年第8期

·1658· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 37 卷

广泛用于生物燃料生产、食品饲料工业和农业等领 为 0.5，NaCl 为 0.5，MgSO 4 为 0.5，KNO 3 为 1，FeSO 4
[5]
域。放线菌是纤维素酶的良好来源 ，具有耐热性、 为 0.01，琼脂为 20，pH 为 7.2~7.4，121 ℃，灭菌
代谢多样性和对极端环境的适应性等特点，能够产 30 min。
[6]
生和分泌多种水解酶，如淀粉酶和脂肪酶 ，与细 ISP3 培养基（g/L）：燕麦片为 20，MgSO 4 为
菌和真菌相比，放线菌在细胞外酶的合成方面具有 0.2，KNO 3 为 0.2，K 2 HPO 4 为 0.5，琼脂为 20，pH
额外的优势。 为 7.2~7.4，121 ℃，灭菌 30 min。
在自然环境中玉米秸秆降解缓慢，秸秆中纤维 GY 培养基（g/L）：酵母粉为 10，葡萄糖为 10，
素的复杂结构和现有菌株的纤维素酶活力不高是制 MgSO 4 为 0.5，K 2 HPO 4 为 0.5，pH 为 7.2~7.4，121 ℃，
约纤维素利用的重要因素，研究发现，由放线菌所 灭菌 30 min。
产的纤维素酶活性较高且结构简单，便于遗传分 CMC 培养基（g/L）：羧甲基纤维素钠为 10，
析。此外，放线菌不会污染环境，还可以改善土壤 NaNO 3 为 2，MgSO 4 为 0.5，K 2 HPO 4 为 1，FeSO 4
[7]
环境 。目前，有许多研究人员正致力于产纤维素 为 0.01，KCl 为 0.5，琼脂为 20，121 ℃，灭菌 30 min。
酶放线菌的筛选及改造 [8-10] 。 产酶培养基（g/L）：羧甲基纤维素钠为 10，
本研究从寒地黑土中筛选出一株产纤维素酶的 (NH 4 ) 2 SO 4 为 4，KH 2 PO 4 为 2，MgSO 4 为 0.5，蛋白
放线菌 GS-4-21，利用响应曲面法对 GS-4-21 降解玉 胨为 10，牛肉膏为 5，pH 为 7.2~7.4，121 ℃，灭
米秸秆的条件进行优化；优化后，通过 SEM 观察降 菌 30 min。
解前后玉米秸秆的形貌，并利用范式洗涤法测定玉 发酵培养基（g/L）：玉米秸秆为 20 g，(NH 4 ) 2 SO 4
米秸秆中主要成分含量的变化。本研究为玉米秸秆 为 4，KH 2 PO 4 为 2，MgSO 4 为 0.5，蛋白胨为 10，
的放线菌降解提供了数据支持。 牛肉膏为 5，pH 为 7.2~7.4，121 ℃，灭菌 30 min。
1.3 方法
1 实验部分
1.3.1 菌株的分离与纯化
1.1 试剂与仪器 称取 1 g 土壤样品，放到 45 mL 无菌水中，在
土壤来源于黑龙江省牡丹江市（东经 128°02′、 28 ℃、180 r/min 条件下振荡 30 min，取上清液稀
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北纬 43°24′）。 释（1×10 、1×10 、1×10 和 1×10 浓度梯度），
可溶性淀粉，分析纯，北京双旋微生物培养基 取各梯度 200 μL 涂于 GS 培养基上，28 ℃培养
制品厂；酒石酸钾钠、羧甲基纤维素钠、氯化钾、 15~30 d。观察平板中菌落的生长，选择不同形态的
硫酸铵，分析纯，天津市致远化学试剂有限公司； 菌落于 ISP3 培养基上，划线纯化 [11] 。
硝酸钾、磷酸氢二钾、硫酸镁，分析纯，天津博迪 1.3.2 初筛与复筛
化工股份有限公司；牛肉膏、蛋白胨，分析纯，济 采用刚果红染色法检测所筛菌株是否可以降解
南金华峰辉生物科技有限公司；番红染液、dNTPs、 纤维素 [12-13] 。将待测菌株点在 CMC 培养基上，于
缓冲液、Taq DNA 聚合酶，分析纯，北京百奥莱博 28 ℃下培养 7~14 d，将质量浓度为 1 g/L 的刚果红
科技有限公司；硫酸亚铁，分析纯，淄博光正铝盐 水溶液倒入培养皿中进行染色，再用 1 mol/L 的
化工有限公司；琼脂，分析纯，广州赛国生物科技 NaCl 溶液进一步洗脱，根据透明圈直径（D）与菌
有限公司；酵母粉，分析纯，北京奥博星生物技术 落直径（d）的比值（D/d）来初步判断该待测菌株
有限公司；硝酸钠，分析纯，南宁市冠德化工有限 降解纤维素的能力。
公司；上游引物、下游引物，吉林省库美生物科技 采用标准曲线法进行定量分析。首先，配制
有限公司；3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，自制。 1 g/L 的葡萄糖标准溶液。取 24 个试管，编号 1、2、
LDZX-75KBS 型立式压力蒸汽灭菌器，济南鑫 3、4、5、6、7、8，每个编号有 3 个平行实验。向
贝西生物技术有限公司；DHG-9123A 型电热恒温培 1、2、3、4、5、6、7、8 号试管分别加入 0、0.2、
养箱，邢台润联机械设备有限公司；S-3400NⅡ型扫 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 和 1.4 mL 葡萄糖标准溶液
描电子显微镜，日本日立公司；ZHJH-C1115B 型超 （1 g/L），再分别加入 2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、
净工作台、THZ-98AB 型恒温摇床培养箱，上海智 0.8、0.6 mL 蒸馏水，最后每个试管加入 1.5 mL DNS
城分析仪器制造有限公司；UV-5200 型紫外分光光 试剂，混匀，于沸水浴中加热 5 min，流水冷却，定
度计，上海元析仪器有限公司；BS 型生物显微镜， 容至 25 mL，用紫外分光光度计在 540 nm 下测量溶
南京翼飞科技有限公司。 液的吸光度值。以葡萄糖含量为横坐标、吸光度值
1.2 主要培养基及配方 为纵坐标进行葡萄糖标准曲线的绘制。
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参照文献[14]方法将菌株制备成 1×10 cfu/mL
GS 培养基（g/L）：可溶性淀粉为 20，K 2 HPO 4