Page 161 - 《精细化工》2020年第8期

第 8 期 刘晓飞，等: 产纤维素酶放线菌的筛选鉴定及其对玉米秸秆的降解 ·1659·

的孢子悬液，体积分数为 1%接种于产酶培养基中， 6、7、8）、接菌量（体积分数 1%、2%、3%、4%、
发酵 7 d 后，采用 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法 5%）、摇床转速（140、160、180、200、220 r/min）
（DNS）测定纤维素内切酶酶活（C X ）、滤纸酶活 和发酵温度（24、26、28、30、32 ℃）对玉米秸秆
（FPA）、纤维素外切酶酶活（C 1 ）和 β-糖苷酶酶活。 降解率的影响，且后续单因素实验均在前一单因素
酶活测定方法参照文献 [15-16] 。 实验的较优结果上进行。
酶活定义：1 mL 酶液于 50 ℃、pH 为 5.0 条件 1.3.5.1 发酵天数
下进行酶解反应，每分钟产生 1 μg 还原糖（以葡萄 在初始 pH 为 7 的发酵培养基中，以体积分数
糖计）的纤维素酶含量定义为一个酶活力单位。 1%的接菌量接种孢子悬液，然后 28 ℃、180 r/min
1.3.3 形态特征观察 振荡培养，考察了不同发酵时间（1、3、5、7、9 d）
形态特征：将菌株 GS-4-21 接种在 ISP3 培养基 对玉米秸秆降解率的影响。
上，置于 28 ℃培养箱中，2 周后观察其菌落形态（基 1.3.5.2 培养基初始 pH
内及气生菌丝的颜色、是否产生色素等情况）。 按体积分数 1%的接菌量接种孢子悬液，28 ℃、
将菌株 GS-4-21 接种在 GY 液体培养基中，之 180 r/min 摇床培养 5 d，考察不同培养基初始 pH
后取适量菌液滴加番红染液进行显微形态特征观察。 （4、5、6、7、8）对玉米秸秆降解率的影响。
1.3.4 分子生物学鉴定 1.3.5.3 培养转速
分子生物学鉴定方法参照文献 [14] ，将质粒送至 在初始 pH 为 6 的液体发酵培养基中，以体积分
吉林省库美生物科技有限公司测序，测序结果在网 数 1%的接菌量接种孢子悬液，28 ℃摇床培养 5 d，
站 https://www.ezbiocloud.net 中比对，采用 MEGA 6 探究不同摇床转速（140、160、180、200 和 220 r/min）
对玉米秸秆降解率的影响。
软件（邻近法）构建系统发育树。
1.3.5.4 发酵温度
以基因组 DNA 为模板，采用 PCR 方法扩增 16S
将孢子悬液按体积分数 1%接种于发酵培养基
rRNA。PCR 扩增体系如表 1 所示。实验所用引物如
（培养基初始 pH 为 6）中，160 r/min 摇床培养 5 d，
表 2 所示。PCR 扩增程序如表 3 所示。
探究不同发酵温度（24、26、28、30 和 32 ℃）对
表 1 PCR 扩增体系 玉米秸秆降解率的影响。
Table 1 PCR amplification system 1.3.5.5 接菌量
试剂 体积/μL 在初始 pH 为 6 的发酵培养基中，接菌量（体积
DNA 模板 1 . 0 分数 1%、2%、3%、4%、5%）不同，28 ℃、160 r/min
上游引物 1 . 0 培养 5 d，探究不同接菌量对玉米秸秆降解率的影响。
下游引物 1 . 0
dNTPs 2.0 1.3.6 玉米秸秆降解率的测定
缓冲液 2 . 0 玉米秸秆降解率的测定参照文献[17]。将玉米
Taq DNA 聚合酶 0 . 2 秸秆烘干至恒重后粉碎，过 40 目筛；然后，在 150 mL
无菌水 13.0 锥形瓶中放入 100 mL 发酵培养基；将发酵后的产物

表 2 实验所用引物 进行抽滤处理，用蒸馏水反复冲洗 3 次，烘干至恒
Table 2 Primers used in this study 重。按下式计算玉米秸秆的降解率。
引物名称 引物序列（5’-3’） 玉米秸秆降解率/%=（发酵前秸秆干重–
27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 发酵后秸秆干重）/发酵前秸秆干重×100（1）
1525R AAGGAGGTGATCCAGCCGCA 1.3.7 响应曲面法优化玉米秸秆降解条件

表 3 PCR 扩增程序 根据单因素实验结果，选取培养基初始 pH
Table 3 PCR amplification procedure （A）、摇床转速（B）、发酵温度（C）和接菌量（D）
为影响因素。因素水平表如表 4 所示。
反应阶段 反应温度/℃ 反应时间
预变性 95 5 min
变性 95 40 s 表 4 响应曲面法因素水平表
复性 55 45 s 30 个循环 Table 4 Table of horizontal factors
延伸 55 90 min
因素
结束 72 10 min 水平 A 培养基初始 B 摇床转速/ C 发酵温度/
D 接菌量/
pH (r/min) ℃ %
1.3.5 玉米秸秆降解单因素实验
1 5 140 26 2
本研究以玉米秸秆的降解率为指标，研究发酵 2 6 160 28 3
时间（1、3、5、7、9 d） 、培养基初始 pH（4、5、 3 7 180 30 4