Page 100 - 《精细化工》2023年第12期

·2642· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 40 卷

存在耗时、样品处理过程复杂及会破坏组织或细胞 （Ac 2 O）、苯胺、尿素、硫脲、羟胺、各种金属盐，
等问题，不适合生物样品中肼的检测。近些年，小 AR，国药集团化学试剂有限公司；柱层析硅胶
分子荧光探针因具有操作简便、灵敏度高、选择性 （200~300 目），青岛海洋化工有限公司；成骨细胞
好、非侵入性以及良好的生物相容性等优点，在分 （MC3T3-E1），国家实验细胞资源共享平台；所用
析检测领域中得到了广泛应用 [14-16] 。迄今为止，已 其他试剂和溶剂均为分析纯，实验中用水均为二次
报道了多种反应机制的肼荧光探针 [17-18] ，例如：选 蒸馏水，自制。
择性脱保护 [19-20] 、与芳醛的缩合反应 [21-22] 、成环反 Bruker Avance NEO 400 MHz 核磁共振波谱仪，
应 [23-24] 、开环反应 [25-26] 、与二氰基乙烯反应成腙 [27-28] 瑞士 Bruker 公司；Agilent 6540 Q-TOF 型质谱仪，美
等，但许多肼荧光探针还存在合成步骤繁琐、检出 国 Agilent 公司；PHSJ-4A 型 pH 计，上海仪电科学仪
限高、检测范围窄等缺点，一些肼荧光探针还会受 器股份有限公司；Leica STELLARIS 5 激光共聚焦显
到其他竞争性胺类化合物的干扰。此外，大多数肼 微镜，德国 Leica 公司；F-4600 荧光分光光度计，日
荧光探针属于 Off-On 型，其测量基于荧光强度的单 本 Hitachi 公司；UV-2450 紫外分光光度计、Prominence
一信号变化，容易受到探针浓度、激发强度、环境 LC-20A 高效液相色谱仪，日本 Shimadzu 公司；
因素等诸多因素的干扰，导致检测误差增大。而比 DNM-9602G 酶标分析仪，北京普朗新技术有限公司。
率型荧光探针凭借两个发射波长的自校准，消除了 1.2 探针 COCB 的合成
可能的外部干扰，具有更高的灵敏度和准确性 [29] 。 探针 COCB 与荧光母体 CHCO 的合成路线如下
目前，用于检测肼的比率型荧光探针还相对较少。 所示：
因此，开发一种合成简便、性能优异的比率型荧光
探针来检测肼具有重要的意义。
香豆素类化合物因具有量子产率高、斯托克斯
位移大、易于修饰以及细胞毒性低等优点，被广泛
用于荧光探针的设计与开发 [30] 。本文拟以香豆素为
荧光团、4-溴丁酰基为识别基团，通过 2 步反应来
合成一种比率型肼荧光探针 3-(4-氯苯基)-2-氧代-2H-

苯并吡喃-7-基-4-溴丁酸酯（COCB）,分别在香豆素 荧光母体 CHCO 的合成：将 2,4-二羟基苯甲醛
的 3-位和 7-位引入电子受体 4-氯苯基和电子给体羟 （0.50 g, 3.6 mmol）、4-氯苯乙酸（0.93 g, 5.4 mmol）
基得到荧光母体 3-(4-氯苯基)-7-羟基-2H-苯并吡喃- 以及三乙胺（1.10 g, 10.8 mmol）置于 50 mL 圆底烧
2-酮（CHCO），形成的推拉电子共轭体系将有效增 瓶中，加入醋酸酐（10 mL），120 ℃油浴加热，反
强分子内电荷转移（ICT）效应 [31] 。4-溴丁酰基作为 应 7 h 后，停止反应，冷却后加水 20 mL，析出固体，
肼的识别基团，一方面，其作为吸电子基能够很好 抽滤、水洗后 60 ℃真空干燥 6 h。将所得固体置于
地抑制探针分子中的 ICT 过程，在探针 COCB 与肼 50 mL 圆底烧瓶中，加入 8 mL 浓盐酸和 4 mL 丙酮，
反应后又能选择性地脱去 4-溴丁酰基，并释放出荧 于 80 ℃油浴中加热搅拌，6 h 后停止反应，冷却后
光母体 CHCO，使 ICT 过程恢复，探针溶液的荧光 抽滤、水洗，60 ℃真空干燥 6 h，得固体粗品。经
发射峰发生明显红移，实现对肼的比率检测；另一 硅胶柱 纯化 〔展开 剂 为 V( 乙酸 乙酯 ) ∶ V( 石油
方面，4-溴丁酰基与肼的取代-环化-消除反应机制 醚)=1∶2 的混合液〕得白色固体 0.60 g，产率为 61%。
能够很好地排除其他胺类化合物的干扰 [32-33] ，提 1 HNMR (400 MHz, DMSO-d 6 ), δ: 10.65 (s, 1H), 8.19
高探针的选择性。本研究有望为环境和生物体内 (s, 1H), 7.73 (d, J =5.6 Hz, 2H), 7.68 (d, J = 5.7 Hz,
痕量肼的识别与检测提供一种简单、有效且实用 1H), 7.49 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 6.83 (dd, J = 5.6、1.0 Hz,
13
的方法。 1H), 6.76 (s, 1H); CNMR (100 MHz, DMSO-d 6 ), δ:
161.45, 159.90, 154.99, 141.41, 133.91, 132.64, 130.11,
1 实验部分 129.99, 128.16, 120.81, 113.48, 111.88, 101.73 。
+
HRMS(ESI), C 15 H 9 ClNaO 3 , m/Z ： [M+Na] 理论值
1.1 试剂与仪器 295.0132；测定值 295.0137。
2,4-二羟基苯甲醛（Ⅰ）、4-氯苯乙酸（Ⅱ）、4- 探针 COCB 的合成 ：将 CHCO （ 0.10 g,
溴丁酰氯、4-二甲氨基吡啶（DMAP）、三乙胺（Et 3 N）、 0.37 mmol），三乙胺（0.11 g, 1.10 mmol）、DMAP
半胱氨酸（Cys）、高半胱氨酸（Hcy）、3-(4,5-二甲 （4.5 mg，0.037 mmol）置于 50 mL 圆底烧瓶中，
基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑（MTT），AR，上 加入 20 mL 二氯甲烷，室温下搅拌。将 4-溴丁酰氯
海麦克林生化科技股份有限公司；水合肼、乙酸酐 （0.10 g, 0.56 mmol）溶于 5 mL 二氯甲烷中，缓慢