Page 101 - 《精细化工》2023年第12期

第 12 期 盛 筱，等: 一种检测环境样品和细胞中肼的香豆素类比率型荧光探针 ·2643·

滴至反应液中；室温下搅拌反应 7 h，除去溶剂，过 量溶液在 490 nm 时的吸光度（OD）。根据式（1）
硅胶柱 纯化 〔展开 剂 为 V( 乙酸 乙酯 ) ∶ V( 石油 计算细胞存活率：
醚)=1∶3 的混合液〕得产物 0.13 g，产率 83%。 OD  OD b
s
1 HNMR (400 MHz, DMSO-d 6 ), δ: 8.31 (s, 1H), 7.82 CV/%＝ OD  OD b  100 （1）

c
(d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.76 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 7.54 (d, J 式中：CV 为细胞存活率，%；OD s 为样品组的吸光
=5.5 Hz, 2H), 7.36 (s, 1H), 7.22 (d, J =5.6 Hz, 1H),
3.65 (t, J = 4.3 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 度；OD c 为不加样品对照组的吸光度；OD b 为不加
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2.18~2.22 (m, 2H); CNMR (100 MHz, DMSO-d 6 ), δ: 样品也不加细胞空白组的吸光度。
170.61, 159.35, 153.48, 152.73, 140.42, 133.40, 133.31, 1.6 细胞成像实验
130.27, 129.58, 128.27, 124.96, 118.85, 117.32, 109.74,
33.86, 32.15, 27.43; HRMS(ESI)，C 19 H 15 BrClO 4 ，m/Z： 将探针 COCB（10 μmol/L）和 MC3T3-E1 细胞
+
[M+H] 理论值 420.9837；测定值 420.9838。 在 37 ℃共培养 30 min，用 PBS 溶液清洗 3 次后分
1.3 表征和性能测试 成两份；一份直接在激光共聚焦显微镜下成像；另
1.3.1 荧光光谱测试 一份细胞中再加入浓度为 500 μmol/L 的肼，共培养
以二甲基亚砜（DMSO）为溶剂配制浓度为 60 min 后用 PBS 溶液清洗 3 次，在激光共聚焦显微
5 mmol/L 探针 COCB 的储备液；将肼、阳离子、阴 镜下成像。此外，将未添加 COCB 和肼的 MC3T3-E1
离子、肼类似物等分析物用二次蒸馏水配制成 细胞进行细胞成像，作为空白对照。荧光成像的激
10 mmol/L 的储备液。测定体系：将 3 μL 探针 COCB 发波长为 405 nm，发射波长范围：蓝色通道 420~
的储备液与适当浓度被测物质的储备液混合，用磷 460 nm；绿色通道 480~520 nm。
酸盐缓冲溶液（PBS 溶液，pH=7.4）/DMSO（体积
比为 1∶1）混合液定容至 3 mL，置于比色皿中。测 2 结果与讨论
试均在室温下进行，反应时间设为 70 min，激发波
2.1 探针光谱性质分析
长为 350 nm，激发和发射狭缝宽度分别为 2.5 和 2.5
首先，在 PBS 溶液/DMSO（体积比为 1∶1）
nm，电压为 700 V。
体系中测 试了探针 COCB （ 5 μmol/L ）对 肼
1.3.2 HPLC 测试
（500 μmol/L，是指在体系中的终浓度，下同）的
化合 物 COCB 和 CHCO 的 测试浓 度均 为
光谱响应，结果如图 1 所示。
5 μmol/L，进样量为 10 μL。流动相为 CH 3 OH/H 2 O
混合液（体积比为 85∶15），流速为 1 mL/min。检 由图 1a 可知，探针 COCB 在 330 nm 处有明显
测波长为 350 nm。色谱柱为 Diamonsil C18(2)柱 的吸收峰；当加入肼后，在 402 nm 处出现一个新的
（150 mm×4.6 mm×5 μm）。 吸收峰，溶液颜色由无色变为浅绿色（图 1a 插图），
1.4 实际水样中肼的检测 与荧光母体 CHCO（5 μmol/L）的紫外-可见吸收谱
按照文献[34]采用标准加入法测定实际水样中 图一致。在荧光发射谱图中（图 1b），选择 350 nm
肼的含量。自来水取自实验室，湖水取自济宁医学 作为激发波长，探针 COCB 的最大荧光发射峰在
院日照校区鉴湖，测试前先用微孔滤膜过滤水样除 420 nm，加入肼后，其最大荧光发射峰红移至 480 nm，
去杂质。以实际水样代替 PBS 溶液进行荧光光谱测 荧光颜色由蓝色变为青色（图 1b 插图），得到的荧
定，测定体系中添加肼的浓度分别为 5、10 和 25 光发射光谱与荧光母体 CHCO 也相吻合。以上结果
μmol/L，其他和上述荧光光谱测定方法相同。 表明，探针 COCB 可用于肼的荧光比率检测。
1.5 细胞毒性测试
将 MC3T3-E1 细胞接种到 96 孔板，用体积分数
10%的 胎牛血清 的杜尔贝科 改良伊格尔 培养 基
（DMEM）于 37 ℃，体积分数 5%的 CO 2 条件下培
养 24 h 至细胞贴壁。然后分别加入不同浓度（10、
20、30、40、50 μmol/L）探针 COCB 的培养基溶液，
并在 37 ℃、体积分数 5%的 CO 2 环境下继续培养
24 h。吸去孔中培养液，每孔加入 20 μL MTT 溶液
（质量浓度为 5 g/L）并补充培养液，在相同条件下
再培养 4 h 后，吸去孔中液体，并加入 DMSO
（150 μL/孔），振荡 10 min。然后用酶标分析仪测