Page 66 - 201808
P. 66

·1314·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                  第 35 卷

                 Foundation (2016M600417, 2017T100373); 333 Project of Jiangsu Province (BRA2017458); Open Funding
                 Project of the State Key Laboratory of Bioreactor Engineering


                 亚氨基二乙酸（Iminodiacetic acid,  IDA）带有            酶的活力和 IDA 的产率。但是，在催化水解反应中
            氨基和羧基两个活泼的官能团，是一种重要的精细                             起到关键作用的腈水解酶还存在一些问题，如催化
            化工中间体，广泛应用于农药、染料、材料、电镀、                            IDAN 水解活力不高、反应中产生单酸及酰胺等副
                               [1]
            电子、水处理等领域 ，其中最主要应用于除草剂                             产物、出现底物抑制的现象等。本课题组前期通过
                         [2]
            草甘膦的合成 。目前，工业上生产 IDA 主要采用                          腈水解酶库筛选，获得一株可高效水解 IDAN 的产
                                                 [4]
                                     [3]
            化学方法，主要有氯乙酸法 、氢氰酸法 、氮川三                            腈水解酶菌株金黄节杆菌 CYC705（Arthrobacter
                   [3]
                                 [5]
            乙酸法 、羟基乙腈法 、二乙醇胺法                  [6-7] 、亚氨基      aurescens CYC705），通过克隆、大肠杆菌异源表达
                             [8]
            二乙腈化学水解法 等。氯乙酸法工艺成熟，但收                             和酶学性质研究发现，该菌所产腈水解酶催化 IDAN
                                    [3]
            率低、成本高、污染严重 。氢氰酸法产率高，缺                             水解活力高，反应过程无酰胺、单酸产生                   [14] 。并通
                                        [4]
            点是氢氰酸剧毒，操作难度大 。氮川三乙酸法原                             过发酵条件优化，实现了大肠杆菌重组金黄节杆菌
            料价廉，合成路线短，操作安全，缺点是原子经济                             CYC705 腈水解酶的高水平发酵制备              [15] 。本文在前
                 [3]
            性差 。羟基乙腈法耗能低、对环境友好，缺点是                             期研究基础上，进一步考察了该酶催化 IDA 合成的
                   [5]
            收率低 。二乙醇胺法收率高，缺点是需要高压反                             生物催化过程，为其工业应用奠定基础。
            应釜，安全要求高，能耗大             [6-7] 。亚氨基二乙腈化学
            水解法能耗高、反应条件苛刻，且设备要求高、生                             1   实验部分
                                    [8]
            产成本高、环境污染严重 。可以看出，化学法都
                                                               1.1   试剂与仪器
            一定程度上存在弊端。
                                                                   氨基载体 HA、环氧基载体 EP，质量分数＞
                 腈水解酶可以一步水解腈类物质转化为羧酸类
                                                               99%，上海佰瑞生物科技有限公司；海藻酸钠、壳
            化合物，具有广泛的底物适应性，水解腈类化合物
                                                               聚糖、戊二醛，分析纯，北京拜尔迪生物有限公司；
            具有专一性、高效性、条件温和、副产物少、环境                             IDA、IDAN，分析纯，梯希爱（上海）化成工业发
                         [9]
            污染少等优点 ，弥补了化学法的局限。反应过程
                                                               展有限公司；甲醇，色谱级，上海阿拉丁生化科技
            如下所示：                                              股份有限公司；其他试剂药品均为市售分析纯。

                                                                   金黄节杆菌 CYC705 腈水解酶大肠杆菌重组表
                                                               达菌株 Escherichia coli BL21（DE3）/pET28a-cyc705
                                                               保存于本实验室；LB 液体培养基（质量分数）：1%

                 利用腈水解酶催化亚氨基二乙腈                                氯化钠、1%蛋白胨、0.5%酵母提取物，并于 121 ℃
            （Iminodiacetonitrile，IDAN）水解为 IDA 已引起人             灭菌 15 min；LB 固体培养基：在 LB 液体培养基中
            们的广泛关注。Liu        [10] 等从土壤中筛选到一株名为                加入 1.8%（质量分数）的琼脂粉；摇瓶发酵培养基
            Alcaligenes faecalis ZJB-09133 的产腈水解酶菌株，全          （质量分数）：3%白糊精、3%花生粉、3%安琪酵母、
            细胞催化 100 mmol/L IDAN 水解，在优化的反应条                    0.5%氯化钠，并于 121 ℃灭菌 15 min。
            件下反应 8 h IDA 产率仅为 65.3%。2012 年 Liu        [11] 等       Sorvall ST 型冷冻离心机，美国 Thermo 公司；
            将 Alcaligenes faecalis ZJB-09133 腈水解酶异源表达          SJ-CJ-1FDQ 型超净工作台，苏州苏洁净化设备有限
            在 E. coli BL21（DE3）中，重组细胞水解 100 mmol/L             公司；HZ-9611K 型温控摇床，太仓华利达实验室设
            IDAN，反应 8 h 时最高产率仅为 68%。2012 年 Zhang        [12]   备公司；UV-1200B 型紫外可见分光光度计，上海美
            等优化了菌株 Alcaligenes faecalis ZJUTBX11 产腈            谱达仪器有限公司；Agilent1100 型高效液相色谱仪，
            水解酶的发酵条件，使得全细胞催化反应 8 h 时的                          安捷伦公司。
            转化率达到 95%，IDA 的得率却只有 79%。2013 年                    1.2    方法
            Liu [13]  等注 入低能 离子 束使 Alcaligenes faecalis        1.2.1   重组 CYC705 腈水解酶的表达
            WBX11 诱变来提高菌株产腈水解酶酶活，诱变后的                              金黄节杆菌 CYC705 腈水解酶的大肠杆菌重组
            Alcaligenes faecalis  WBX11 突变体在 8 h 时能完全          表达、分离纯化按文献[14-15]方法进行。培养收集
            转化 150 mmol/L IDAN，但 250 mmol/L IDAN 仅能            的重组大肠杆菌细胞一部分用于菌体细胞固定化，
            转化 72%。从上述研究可知，通过腈水解酶的改造、                          一部分超声破碎离心获得上清液后经镍柱纯化获得
            发酵条件优化、催化条件优化等方法可提高腈水解                             纯化酶液用于 CYC705 腈水解酶的固定化。
   61   62   63   64   65   66   67   68   69   70   71