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第 8 期 杨 猛，等: 金黄节杆菌 CYC705 腈水解酶催化亚氨基二乙酸的合成 ·1317·
（pH=6.6），发现磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲体系中壳 金属离子对壳聚糖固定化细胞催化 IDA 合成的影响见
聚糖固定化细胞的催化效率优于磷酸盐缓冲体系， 图 4。
且交接点 pH=6.6 是最适的催化反应 pH。本课题组
前期研究中发现游离的 CYC705 腈水解酶的最适 pH
为 5.8 [14] 。可见经重组固定化之后，固定化细胞的最
适催化 pH 增加了 0.8。
如图 2b 所示，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液与
Tris-HCl 缓冲液效果相当，磷酸盐缓冲液效果最差。
一水合柠檬酸的价格为 3000 元/t，磷酸氢二钠的价
格为 2000 元/t，Tris 的价格为 13 万元/t。基于成本
考量，pH=6.6 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液优选为催
化反应的缓冲液。
缓冲液的离子强度也是影响催化反应的重要因
素。离子强度太小，缓冲能力不够，反应产生的 IDA 图 4 金属离子对壳聚糖固定化细胞催化 IDA 合成的影响
使体系的 pH 偏离 CYC705 腈水解酶的最适 pH。离 Fig. 4 Effect of metal ion on the synthesis of IDA catalyzed
by chitosan immobilized cells
子强度太大，会造成酶活的损失。本文考察了不同
离子强度对催化反应的影响。结果发现离子强度的 如图 4 所示， 各金属离子 添加量较少 时
2+
大小对产率的影响不大，50 mmol/L 的磷酸氢二钠- （0.1 mmol/L），除 Co 有一定的促进作用外，其他
柠檬酸缓冲液效果稍好。 金属离子对催化反应的影响不明显。当金属离子添
2.2.2 温度对催化反应的影响 加量较大时（1.0 mmol/L），对催化反应影响显著，
2+
2+
温度是影响生物催化反应的重要因素之一。反 促进作用最大的金属离子为 Co ，其次是 Ca 、
2+
2+
应温度对壳聚糖固定化细胞催化 IDA 合成的影响见 Zn ，而 Cu 对催化反应有抑制作用。因此，在催
图 3。 化反应过程中，可选择添加终浓度为 1 mmol/L 的
CoCl 2 溶液。
2.2.4 底物浓度对催化反应的影响
IDAN 有一定的毒性，在腈水解酶催化水解过
程中，过高浓度的 IDAN 可能对腈水解酶有一定的
毒害或抑制作用。IDAN 浓度对壳聚糖固定化细胞
催化 IDA 合成的影响见图 5。
图 3 反应温度对壳聚糖固定化细胞催化 IDA 合成的影响
Fig. 3 Effect of reaction temperature on the synthesis of
IDA catalyzed by chitosan immobilized cells
如图 3 所示，随着反应温度的升高，IDA 的产
率不断增加，到 37 ℃时产率达到最大，随后随着温
度升高，IDA 的产率下降。本课题组前期的研究中发 图 5 IDAN 浓度对壳聚糖固定化细胞催化 IDA 合成的影响
现游离的 CYC705 腈水解酶的最适温度为 25 ℃ [14] 。 Fig. 5 Effect of IDAN concentration on the synthesis of
IDA catalyzed by chitosan immobilized cells
可见经固定化之后，固定化细胞的最适温度提高了
12 ℃。最终选择 37 ℃作为催化反应的温度。 如图 5 所示，50 mmol/L 的 IDAN 1 h 内就能水
2.2.3 金属离子对催化反应的影响 解完全；100 和 150 mmol/L 的 IDAN 2 h 内能水解
腈水解酶大多数情况下是金属酶，添加合适的 完全；200 mmol/L 的 IDAN 3 h 内就能水解完全，
金属离子添加往往对腈水解酶的催化有促进作用。 这 4 种不同浓度底物得到的 IDA 产率均接近 100%；
