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第 8 期 杨 猛，等: 金黄节杆菌 CYC705 腈水解酶催化亚氨基二乙酸的合成 ·1315·

1.2.2 HA 和 EP 固定化 CYC705 腈水解酶 反应生成的 IDA质量
时空产率/ [g / (L d)] =
氨基载体HA和环氧基载体EP的活化按照文献[16] 反应体系体积 反应时间
报道方法进行。固定化酶的制备参考文献[16]方法 1.2.6 CYC705 腈水解酶催化 IDA 合成的一般步骤
并稍作修改：取 50 mL 1.2.1 节中制备好的纯化酶液 用缓冲液配制一定浓度的 IDAN 溶液作为反应
置于 250 mL 摇瓶中，加入 5 g 活化好的 HA，在 25 ℃ 底物，取适量的底物溶液加入一定量的不同形式的
振荡固定 4 h 后滤出，用生理盐水洗涤 3 遍得 HA 腈水解酶催化剂于一定温度下 200 r/min 振荡反应，
固定化 CYC705 腈水解酶。取 50 mL 1.2.1 中制备好 不同时间取样 100 µL，加入 5 µL 6 mol/L 盐酸溶液
的纯化酶液置于 250 mL 摇瓶中，调节离子强度达到 终止反应。然后于 8000 g 离心 10 min，取上清液通
1 mol/L，加入 5 g 活化好的 EP，在 25 ℃振荡固定 过 HPLC 测定生成的 IDA 量。
30 h 后滤出，用生理盐水洗涤 3 遍得 EP 固定化 1.2.7 CYC705 腈水解酶催化 IDA 合成过程优化
CYC705 腈水解酶。 反应体系考察：（1）pH 的影响。配制 100 mmol/L
1.2.3 海藻酸钠固定化含 CYC705 腈水解酶细胞 不同 pH 的缓冲液（pH=4.8、5.4、6.0、6.6 的磷酸
参考文献[17]方法并稍作修改：制备质量分数 氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH=6.6、7.0、7.4、7.8 磷酸
为 5%海藻酸钠溶液和湿重为 10%~20%（质量分数） 盐缓冲液，pH=7.8、8.2、8.6、9.0Tris-HCl 缓冲液），
的菌液，将二者等体积混合均匀。用无菌注射器将 用这些缓冲液配制 100 mmol/L IDAN 底物溶液，取
混合液缓慢滴入四倍体积的 0.1 mol/L CaCl 2 溶液 5 mL 底物溶液分别加入 0.1 g 壳聚糖固定化细胞，
中，形成直径约为 2~3 mm 的小球，4 ℃下静置硬化 在 30 ℃下反应，考察反应体系 pH 对 IDA 合成的影
4 h 后滤出，用生理盐水洗涤 3 遍，收集海藻酸钠固 响。（2）缓冲液类型的影响。配制 100 mmol/L pH=6.6
定化细胞小球。 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、
1.2.4 壳聚糖固定化含 CYC705 腈水解酶细胞 Tris-HCl 缓冲液，按考察不同 pH 影响相似的方法考
参考文献[18]方法并稍作修改：将壳聚糖粉末 察不同缓冲体系类型的影响。 （3）缓冲液离子强度
加入 2%（体积分数）的冰醋酸溶液，配制成 3%（质 的影响。配制离子强度分别为 50、100、150、200、
量分数）的壳聚糖溶液，搅拌均匀，得透明溶液。 250、300 mmol/L 的 pH=6.6 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲
制备湿重为 10%~20%（质量分数）的菌液，与壳聚 液，按考察不同 pH 影响相似的方法考察不同离子
糖溶液等体积混合均匀。加入 1%（体积分数）的戊 强度缓冲液的影响。
二醛，搅拌均匀，静置 3 h，成胨状。加入 1%（质量 反应条件考察：（1）温度的影响。用 50 mmol/L
分数）的碳酸氢钠，搅拌 2 h。胶胨均匀分散成颗粒。 pH=6.6 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制 100 mmol/L
用生理盐水洗涤 3 遍，收集壳聚糖固定化细胞颗粒。 IDAN 底物溶液，取 5 mL 底物溶液加入 0.1 g 壳聚
1.2.5 腈水解酶酶活、蛋白浓度的测定 糖固定化细胞，分别在 15、20、25、30、37、42、
用 100 mmol/L pH=7.2 的磷酸盐缓冲液配制 50 ℃下反应。（2）金属离子的影响。用 50 mmol/L
1.0%（质量分数）IDAN 溶液作为底物。取 500 µL pH=6.6 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制 100 mmol/L
2+
底物溶液，加入适量的酶液或固定化酶或游离全细 的 IDAN 作为底物，向底物溶液中分别添加含 Fe 、
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
胞或固定化细胞，于 30 ℃、150 r/min 振荡反应 15 min。 Mg 、Ca 、Cu 、Zn 、Co 、Ni 和 Mn 等金属
取样 100 µL，加入 5 L 6 mol/L 盐酸溶液终止反应。 离子的盐使终浓度达到 0.1 mmol/L 和 1 mmol/L，添
然后于 8000 G（重力加速度）离心 10 min，取上清 加 0.1 g 壳聚糖固定化细胞，在 37 ℃下反应 0.25 h。
液通过 HPLC 定量测定生成的 IDA。上述条件下每 （3）底物浓度的影响。用 50 mmol/L pH=6.6 的磷
分钟水解 IDAN 生成 1 moL IDA 所需要的酶量定 酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制 50~500 mmol/L 的
义为 1 个腈水解酶单位（U）。蛋白浓度测定采用 IDAN 溶液（CoCl 2 的终浓度均为 1 mmol/L）作为底
Bradford 法 [19] 。固定化及反应评价标准按下式计算： 物，添加 0.1 g 壳聚糖固定化细胞，在 37 ℃下反应
酶的固定化率/%=（固定化前酶液中的蛋白质 6 h。（4）固定化细胞投量的影响。用 50 mmol/L
量−固定化后上清残余蛋白质量）/固定化前酶液中 pH=6.6 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制200 mmol/L 的
蛋白质量×100 IDAN 溶液（CoCl 2 的终浓度为 1 mmol/L）作为底物，
细胞固定化率/%=（固定化前溶液中细胞质量− 添加 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g 壳聚糖
固定化后上清残余细胞质量）/固定化前溶液中细胞 固定化细胞，在 37 ℃下反应。
质量×100 反应体系放大：用 50 mmol/L，pH=6.6 的磷酸
酶活回收率/%=固定化酶或细胞的总酶活/投入 氢二钠-柠檬酸缓冲液配制 200 mmol/L 的 IDAN 溶
酶液或细胞的总酶活×100 液（含终浓度为 1 mmol/L 的 CoCl 2 ）作为底物，取