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·450·                             精细化工   FINE CHEMICALS                                  第 36 卷

                 成团泛菌(P. agglomerans)是革兰氏阴性细菌，                 1   实验部分
            能 在细胞内 合成一种 重要的次 级代谢产 物
                                                       [1]
            Andrimid，能强烈抑制乙酰辅酶 A 羧化酶活性 。                       1.1    材料
                                                               1.1.1    菌株、质粒和培养基
            Andrimid 作为一种新的多肽类抗生素近年来受到广
                                                                   Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109
            泛关注， 其 重要的结 构 单元是 - 苯 丙氨酸。 P.
                                                               购自宝生物工程（大连）有限公司；克隆载体 pMD18-
            agglomerans 中的苯丙氨酸氨基变位酶（PAM）可催
                                       [2]
            化-苯丙氨酸合成-苯丙氨酸 。同时，-苯丙氨酸                         T 和表达载体 pET28a（+）均购自美国 Invitrogen
                                                               公司。实验中所用培养基均为 Luria-Bertani（LB）
            是一种重要的工业原料，广泛应用于内酰胺，萜类、
            生物碱及活性多肽等药物的生产中                 [3-4] 。目前，-苯      培养基。
                                                               1.1.2    主要试剂和仪器
            丙氨酸主要采用不对称化学合成，但生产工艺复杂，
                                                                   质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒均购自上海生
            副产物多，而且存在环境污染问题，迫切需要建立
                         [5]
            绿色合成方法 。酶法转化具有工艺简单、生产过                             物工程有限公司；限制性核酸内切酶 EcoRⅠ和 Hind
                                                               Ⅲ、蛋白质 Marker、DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶
            程绿色、无环境污染等优点，因而越来越受到重视。                            均购自宝生物工程（大连）有限公司；用于酶学分
                                                     [6]
            目前，酶法合成-苯丙氨酸主要采用脂肪酶 、青                            析的底物-苯丙氨酸、-苯丙氨酸均购自 Sigma 公
                       [7]
            霉素酰化酶 及氨基转移酶             [8-9] 等，需要添加外源性
                                                               司，其他试剂为国产 AR。
            辅因子，如金属离子、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
                                                                   基因扩增仪（PCR 仪，美国 Bio-Rad 公司）；
            （NADH）或黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH2）及磷
                                                               LCMS-8030 三重四极杆质谱仪、LC-20 高效液相色
            酸吡哆醛（PLP）等，导致反应过程复杂，难以实                            谱仪，日本 Shimadzon 公司；Bruker Ultrashield 400
                               [9]
            现大规模工业化生产 。因而，催化工艺步骤少、
                                                               PLUS 型核磁共振波谱仪，德国 Bruker 公司；超声
            生产工艺简单、无需添加辅因子的酶法合成方法更
                                                               波细胞破碎仪，美国 Branson 公司；AKTAprime 蛋
            具应用潜力。由于苯丙氨酸氨基变位酶不需要添加
                                                               白纯化仪，美国 GE  Healthcare  公司；Z326K 型高
            外源性辅因子，能够一步异构化-苯丙氨酸产生-
                                                               速冷冻离心机，德国 Hermle 公司。
            苯丙氨酸（反应式如下所示），因而与其他酶法合成
                                                               1.2    方法
            相比具有更好的应用前景            [10] 。                      1.2.1    基因克隆

                                                                   根据 GenBank 中提供的 P. agglomerans 苯丙氨
                                                               酸氨基变位酶基因（pam）序列（AY192157.1），委
                                                               托上海生物工程公司合成基因 pam，并插入克隆载
                                                               体 pUC18T-pam 中，在基因的两端引入限制性核酸
                                                               内切酶 EcoRⅠ和 Hind  Ⅲ的酶切位点。利用 EcoR
                                                               Ⅰ和 Hind  Ⅲ同 时对 pUC18T-pam 和 表达载 体
                 目前，对苯丙氨酸氨基变位酶的研究主要集中
                                                               pET28a（+）进行双酶切，割胶回收目的基因片段
            在来源于植物紫杉（Taxus chinensis）的苯丙氨酸氨                    和 pET28a（+）载体；然后，将双酶切产物（目的
            基变位酶     [11-12] ，对来源于微生物的酶的报道相对较
                                                               基因）与载体 pET28a（+）于 16 ℃下过夜连接，将
            少， 有报道来源 于微生物链 霉菌（ Streptomyces
                                                               连接产物转入 E.coli  JM109 中，涂布含有卡那霉素
            maritimus）的苯丙氨酸氨基变位酶具有较好的热稳
                                                               （50  mg/L）的 LB 平板，于 37 ℃培养，阳性重组
            定性，但催化效率较低           [13-14] 。为满足工业应用，需
                                                               子采用菌落 PCR 和质粒双酶切进行鉴定，送上海生
            要获得催化效率高、热稳定性好的微生物来源的苯
                                                               工测序确认基因序列，构建重组表达质粒命名为
            丙氨酸氨基变位酶，因而可克隆革兰氏阴性细菌 P.
                                                               pET28a-pam。
            agglomerans 中的苯丙氨酸氨基变位酶基因，构建表
                                                               1.2.2    重组酶的表达及分离纯化
            达载体，转入大肠杆菌中进行异源表达，制备重组
                                                                   将  pET28a-pam 转入 E.coli BL21 中，涂布含有
            酶，用于合成-苯丙氨酸。                                      卡那霉素（50 mg/L）的 LB 平板，于 37 ℃培养 12 h，
                 本文克隆了来源于 Pantoea agglomerans 的苯丙
                                                               挑取单菌落至 5  mL 的 LB 培养基中，于 37 ℃培养
            氨酸氨基变位酶基因（pam），构建了表达载体，                            10 h。取 5 mL 培养液至 500 mL 的 LB 培养基中，
            转入大肠杆菌中进行异源表达，采用亲和层析制                              于 37 ℃培养至吸光度值（OD 600 ）为 0.6 时，加入
            备电泳纯的重组酶（PaPAM），用于催化合成-                           终浓度为 0.  4  mmol/L 的诱导剂异丙基-β-D-硫代半
            苯丙氨酸。                                              乳糖苷（IPTG），于 26 ℃诱导表达 12 h 后，离心收
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