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第 3 期            朱龙宝，等:  成团泛菌苯丙氨酸氨基变位酶的性质表征及用于合成-苯丙氨酸                                   ·451·


            集菌体。用 A 液（20 mmol/L 磷酸钠+0.5 mol/L NaCl+            以未加金属离子及表面活性剂反应体系测得的酶
            5 mmol/L 咪唑，pH 8）重悬菌体，超声破碎（功率                      活力为 100%计算相对酶活力，研究其对酶活性的
            250 W，超声 1 s，间歇 3 s，共 15 min）后冷冻离心，                影响。
                                                                          +
            收集上清液。将上清液采用 His-Trap TM/FF 亲和层                    1.2.5.4    NH 4 浓度对酶活性的影响
            析柱进行分离纯化，用 B 液（20  mmol/L 磷酸钠+                         在反应体系中分别加入终浓度为 0.05~2.5 mol/L
            0.5 mol/L NaCl+250 mmol/L 咪唑，pH 8）进行梯度             的氨水溶液，同时用盐酸调整 pH，在最适温度、最
                                                                              +
            洗脱，收集活性部分，采用 SDS-PAGE 检测酶蛋白                        适 pH 下测定 NH 4 对酶活性的影响。
            纯度。
            1.2.3    酶活力及动力学参数检测                               2    结果与分析
                 取适量的酶液与 400  μL 三羟甲基氨基甲烷
                                                               2.1    表达载体构建
            （Tris）-盐酸缓冲液（25 mmol/L，pH 9）和 100 μL
                                                                   对 1.2.1 节构建的表达载体 pET28a-pam 进行
            底物-苯丙氨酸混合，反应总体积为 500  μL。于
                                                               EcoRⅠ和 Hind  Ⅲ双酶切验证，琼脂糖凝胶电泳结
            30 ℃反应 10 min 后加入 500 μL 无水甲醇终止反应。
                                                               果如图 1 所示。在 1600 bp 左右出现目的基因条带，
            用 C18 反相色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）检测
                                                               与理论值相一致，表明成功构建表达载体 pET28a-
            β-苯丙氨酸，流动相为甲醇（0~15  min，甲醇体积
                                                               pam ， 并将其送 往上海生工 测序，测序 结果 与
            分数由 20%增加到 50%），进样 20  μL，流速
                                                               GenBank 中 P. agglomerans 苯丙氨酸氨基变位酶基
            1 mL/min，柱温 30 ℃，检测波长 245  nm。酶活单
                                                               因序列（AY192157.1）完全一致。
            位的定义：30 ℃下每分钟生成 1 μg 的-苯丙氨酸需

            要的酶量为 1 个酶活单位（U）。
                 表观米氏常数（K m ）及转换常数（K cat ）的测定：
            配制不同浓度的-苯丙氨酸底物溶液，分别与酶液
            在 30 ℃、pH  9 条件下反应，测定酶反应速率，然
            后按照米氏方程，采用 Lineweaver-Burk 作图法确定
            酶的 K m 及 V max 值，根据公式 K cat =V max /酶浓度，求
            重组酶的 K m 和 K cat 。
            1.2.4    蛋白质含量测定
                 酶蛋白质含量采用 Bradford 法测定          [15] 。
            1.2.5    酶学性质表征
            1.2.5.1    温度对酶活性的影响
                 在 pH  9.0，15~45 ℃下测定酶活力，确定酶反
            应最适温度。为研究酶的热稳定性，分别将酶在 40、
                                                               M：DNA  marker；泳道 1 和 2 代表 EcoRⅠ和 Hind  Ⅲ双酶切重
            50、60 ℃下保温 0.5~3.0 h 后测定残余酶活力，并以                   组质粒 pET28a-pam
            在 30 ℃下测定的酶活力为 100%计算相对酶活力。                        图 1    EcoR Ⅰ和 Hind  Ⅲ双酶切验证重组表达载体
            1.2.5.2    pH 对酶活性的影响                                    pET28a-pam
                                                               Fig. 1    Identification of recombinant pET28a-pam digested
                 在 30 ℃下，分别在不同缓冲体系（pH  5~7，
                                                                     with EcoRⅠand Hind  Ⅲ
            25 mmol/L 醋酸钠缓冲液；pH 7~9，25 mmol/L Tris-
            盐酸；pH 9~10，25 mmol/L 碳酸钠缓冲液）中测定                    2.2    重组酶的表达和纯化
            酶活力，确定酶催化反应的最适 pH。将酶分别溶解                               将表达载体 pET28a-pam 转入 E. coli BL21，挑
            于不同 pH 的缓冲体系（pH  7~9，25  mmol/L  Tris-             选重组子于 37 ℃培养至 OD 600 为 0.6 时加入 IPTG，
            盐酸；pH 9~10）中并保持 4~24 h，每隔 4 h 取样测                  使 IPTG 终浓度为 0.4  mmol/L，于 26 ℃诱导培养
            定剩余酶活力，以 pH 9 下测定的酶活力为 100%计                       12 h。离心收集菌体，超声破碎细胞后离心，分别
            算相对酶活力，以确定酶的 pH 稳定性。                               取上清液和沉淀进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝
            1.2.5.3    金属离子及表面活性剂对酶活性的影响                       胶电泳（SDS-PGAE）检测，结果如图 2 所示。由
                 在反应体 系中分别 加入不同 的金属离子                          图 2 可知，带有 pET28a-pam 的重组子在 IPTG 诱导
                                      3+
                                                        2+
                                            2+
                           +
                                                  2+
                                 2+
            （1 mmol/L，Na 、Mg 、Fe 、Ca 、Cu 、Zn 、                 下成功实现了表达，在 60 kDa 出现可溶性的目的蛋
               2+
            Mn ）和表面活性剂（1 mmol/L，Triton 100、Tween               白条带，条带的大小与理论值一致，pam 在大肠杆
            80、SDS、CTAB）。在 30 ℃、pH 9 下测定酶活力，                   菌中实现了高效表达。进一步采用 His  Trap  TM/FF
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