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·454·                             精细化工   FINE CHEMICALS                                  第 36 卷

                      +
            2.4.4    NH 4 浓度对酶活性的影响                            2.4.6    -苯丙氨酸的合成
                 在反应体系中分别加入浓度为 0.05~2.5  mol/L                     向含有 50~250  mmol/L 底物 α-苯丙氨酸的 Tris
            的氨水，用盐酸调整 pH 为 9，结果如图 7 所示。当                       盐酸缓冲液中（25 mmol/L, pH 9）加入 10 U 的重组
            铵离子低于 1.5 mol/L 时，对酶催化活力有明显促进                      PaPAM，于 30 ℃下催化 22  h 合成-苯丙氨酸，结
            作。根据 PaPAM 催化反应过程，PaPAM 首先催化                       果如图 8 所示。底物为 50 mmol/L 时，10 h 转化率
            底物 α-苯丙氨酸脱除 α-氨基，形成中间产物反式肉                         达到 92.1%，浓度为 100 mmol/L 时，经过 22 h 反应
            桂酸和铵离子，形成的肉桂酸和铵离子仍然停留在                             转化率达到 92%，当底物浓度为 150 mmol/L 时，22 h
            酶活性中心，然后 PaPAM 将铵再次传递给中间产                          转化率为 65%左右，超过 150 mmol/L 时，转化率低
            物反式肉桂酸的 β 位碳原子，形成产物 β-苯丙氨酸。                        于 60%。可能是产物的抑制作用导致转化率下降。
            在反应体系中添加一定浓度的铵离子，可能有利于                             所以，最适的底物浓度为 100 mmol/L。为验证是否
            反应平衡向生成产物 β-苯丙氨酸的方向移动，从而                           存在产物抑制现象，向含有 100 mmol/L 底物-苯丙
            在反应体系中添加铵离子促进酶活性的提高，但铵                             氨酸的溶液同时加入 100 mmol/L 的-苯丙氨酸，酶
            离子浓度超过 1.5 mol/L 时，可能影响酶蛋白的电荷
                                                               转化 22 h，测定底物-苯丙氨酸的转化率，底物-
            性质，导致酶的胶体性质及结构发生改变，从而抑
                                                               苯丙氨酸的转化仅为 40%左右，明显低于不添加-
            制酶的活性。                                             苯丙氨酸时的转化率，表明存在产物抑制现象。


















                      图 7    铵离子浓度对酶活性的影响
                               +
            Fig.  7    Effects  of  NH 4   concentration  on  the  activity  of   图 8    重组 PaPAM 催化底物-苯丙氨酸合成-苯丙氨酸
                   recombinant PaPAM                                的过程
                                                               Fig. 8    Synthesis  of - phenylalanine  from - phenylalanine
            2.4.5    不同来源苯丙氨酸氨基变位酶的催化效率                              catalyzed by the recombinant PaPAM
                 根据不同底物浓度与酶促反应的关系，按照米
                                                               3    结论
            氏方程，采用 Lineweaver-Burk 作图法，求重组酶的
            表观米氏常数，结果如表 1 所示。PaPAM 的 K m 为                         成 功构建了 PaPAM 的 大肠杆菌表 达载 体
                                          –1
                                       –4
            0.0199 mmol/L，K cat 为 2.2×10  s ，K cat /K m 为 11.2×   pET28a-pam，在 E.coli BL21 中实现了高效表达，采
              –3
            10   mmol/(L·s), S. maritimus 和 T. chinensis 来源的
                                                               用亲和层析的方法成功制备出电泳纯的 PaPAM。重
            苯 丙 氨酸氨 基 变位酶 的 K cat /K m 分别为 7.19×               组 PaPAM 能够异构化-苯丙氨酸，催化生成-苯丙
                                  –4
              –3
            10  mmol/(L·s)和 3.8×10  mmol/(L·s)，表明微生物
                                                               氨酸，在单因素分析基础上的最适反应条件下
            来源的催化效率明显高于植物来源的酶，而微生物
                                                                                            +
                                                               （30 ℃、pH  9、1.5  mol/L  NH 4 ），重组酶的活性
            中 PaPAM 的催化效率（K cat /K m ）更高，表明 PaPAM
                                                               达到 2.5  kU/g，重组酶具有较高的温度和 pH 稳定
            比 SmPAM 更具应用前景。
                                                               性，在最佳反应条件下，转化率达到 96%，来源于
                   表 1  苯丙氨酸氨基变位酶的动力学参数                        P. agglomerans 的苯丙氨酸氨基变位酶具有较好的应
             Table 1    Kinetic parameters of phenylalanine aminomutase   用前景，为后续的进一步生产-苯丙氨酸奠定基础。
                       K m     K cat /   (K cat/K m)/   Ref
             Enzyme             –3  –1   –3
                    /(mmol/L)  (×10  s )  〔×10  mmol/(L·s)〕    参考文献：
              PaPAM   0.0199   0.220      11.20     This work  [1]   Jin M, Fischbach M A, Clardy J. A biosynthetic gene cluster for the
             SmPAM   0.0220   0.159        7.19       [13]         acetyl-CoA  carboxylase  inhibitor  andrimid[J].  Journal  of  the
              TcPAM   0.0340   0.013       0.38     [17-18]        American Chemical Society, 2006, 128(33): 10660-10661.

                 Pa, Sm, Tc are P. agglomerans, S. maritimus and T. chinensis,
            respectively.                                                                     （下转第 460 页）
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