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·456·                             精细化工   FINE CHEMICALS                                  第 36 卷

            染大、成本高；发酵法生产丙酮酸转化率低、操作                             1.2   方法
            繁琐易染菌、生产周期长            [13] 。因此，寻求能够廉价             1.2.1    菌体细胞制备
            生产丙酮酸的方法意义重大。                                          将上述 3 个菌种分别接于 LB 斜面 37  ℃培养
                 本文首先通过一锅酶法，将底物甘氨酸、甲醛和                         8 h，然后用接种环从 LB 斜面上刮取菌体接入装有
            苯酚经分别来源于 Achromobacter spanius 的醛缩酶                50 mL TB/Kana 培养基的 250 mL 三角瓶中培养 8 h，
            （ALD，EC4.1.2.13）、Bacillus subtilis 的 D-丝氨酸         再将活化好的种子液接入装有 100  mL  TB/Kana 培
            脱水酶（SDH，EC4.3.1.18）和 Citrobacter freundii          养基的 500  mL 三角瓶中，接种量为体积分数
            的 TPL（EC4.1.99.2）三酶催化反应得到产物 L-Tyr，                 0.8%~1.2%。37  ℃摇床培养至菌体 OD 600 为 4.0~6.0，
            然后优化了转化工艺条件；最后，利用该工艺进行                             加入终浓度 0.3  mmoL/L 的异丙基-β-D-硫代半乳糖
            中试放大验证，并考察了 L-Tyr 的收率，反应式如                         苷（IPTG），28  ℃诱导 12 h。发酵结束后于 5000 r/min
            下所示。该三酶偶联体系中，通过 ALD 和 SDH 的                        离心 15 min，收集菌体细胞，分别得到 3 种细菌的
            联用生成丙酮酸，且该体系避免了 D-丝氨酸和丙酮                           菌泥。
            酸的提取步骤，节省反应时间、提高效率，大大降                             1.2.2    三酶偶联反应
            低了 L-Tyr 的生产成本，有望解决丙酮酸成本高的                             500  mL 反应体系：向 1  L 三口烧瓶中加入水
            问题。                                                350 mL、甘氨酸  25 g（0.3 mol）、磷酸吡哆醛（PLP）

                                                               0.05 g（0.2 mmol）、甲醛 4 g（0.13 mol）、无水 Na 2 SO 3
                                                               1.2 g（9.5 mmol）、EDTA 1.2 g（4.1 mmol）、乙酸铵
                                                               3 g（0.039 mol）、用 NaOH 稀溶液将 pH 控制在 8.4~
                                                               8.6，再加入 30 g 产 ALD 菌体细胞、15 g 产 SDH 菌
                                                               体细胞、25  g 产 TPL 菌体细胞，温度控制在 33~
                                                               37 ℃。以 50 mg/min 的速度流加苯酚，开始反应，
                                                               反应过程中用甲醛将 pH 控制在 8.4~8.6。流加完 31.5 g

                                                               苯酚后再继续搅拌反应 30  min，停止反应。利用
                                                               HPLC 检测转化液中苯酚的残留以及 L-Tyr 生成量。
            1    实验部分
                                                               1.2.3    ALD 酶活测定
            1.1   材料                                               取 0.1 g 产 ALD 细胞菌体，加入 10 mL 反应体
            1.1.1    菌种与试剂                                     系：甘氨酸质量分数 1%，甲醛质量分数 1%，
                 基因工程重组菌 E.coli  BL21(DE3)/pET26b-             4 mmol/L PLP，稀盐酸调 pH=8.5，35  ℃，200 r/min
            ALD、E.coli BL21(DE3)/pET26b-SDH 和 E.coli BL21      条件下进行酶促反应，10 min 取样，用浓盐酸终止
            (DE3)/pET26b-TPL，长兴制药股份有限公司研发中                     酶促反应，利用 HPLC 检测反应液中 D-丝氨酸的浓
            心分子平台构建并保存；甘氨酸、苯酚，AR，国药                            度。酶活定义为上述条件下每分钟内催化生成
            集团化学试剂有限公司；磷酸吡哆醛，AR，西格玛                            1 μmol D-丝氨酸所需要的酶量为一个酶活单位（U）。
            公司；卡那霉素（Kana），AR，上海生工生物工程                              D-丝氨酸色谱条件：Daicel CROWNPAKCR(+)
            股份有限公司；其他常规试剂均为市售分析纯。                              色谱柱（150  mm×4  mm）；流速 0.3  mL/min；柱温
            1.1.2    培养基                                       30  ℃；检测波长 200 nm；流动相 pH=1.0 的高氯酸
                 LB(Luria-Bertani 培养基)/Kana 斜面培养基：蛋            水溶液   [14] 。
            白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂                1.2.4    SDH 酶活测定
            粉 20 g/L。调节 pH=7.2，121  ℃灭菌 20 min。待培                  取 0.1 g 产 SDH 细胞菌体，加入 10 mL 反应体
            养基冷却至 40~50  ℃，添加事先配制成一定浓度过                        系：D-丝氨酸质量分数 1%，稀盐酸调 pH=8.5，35 ℃，
            滤除菌后的 Kana，使其终质量浓度为 50  mg/L，制                     200 r/min 条件下进行酶促反应，10 min 取样，用浓
            作斜面。                                               盐酸终止酶促反应，利用 HPLC 检测反应液中丙酮
                 TB(Terrific Broth 肉汤培养基)/Kana 培养基：蛋           酸的浓度。酶活定义为上述条件下每分钟内催化生
            白胨 12 g，酵母提取物 24 g，甘油 4 mL，溶解于 0.9 L               成 1 μmol 丙酮酸所需要的酶量为一个酶活单位（U）。
            水中，121  ℃灭菌 20  min。待其冷却到 60  ℃，再                      丙酮酸色谱条件：色谱柱 WondaSil  C18 柱
            加入 100 mL 灭菌后含有 0.17 mol/L KH 2 PO 4 和 0.72        （250 mm×4.6  mm×5  μm）；流动相 V〔5.5  mmol/L
            mol/L K 2 HPO 4 的溶液，并添加事先配制成一定浓度                   二环己胺和 0.02  mol/L 的甲酸水溶液〕∶V(乙腈)=
            过滤除菌后的 Kana，使其终质量浓度为 50 mg/L。                      95∶5；检测波长 230  nm；流速 0.6  mL/min；进样
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