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第 3 期 陈明亮，等: 三酶偶联全细胞生物合成 L-酪氨酸 ·457·

量 20 μL；柱温为室温 [15] 。 温度对 SDH 酶活的影响：向 10 mL 含有 0.1 g D-
1.2.5 TPL 酶活测定 丝氨酸的水溶液中加入产 SDH 细胞菌体 0.1 g，
取 0.1 g 产 TPL 细胞菌体，加入 10 mL 反应体 pH=8.5，200 r/min 搅拌速度，不同温度条件下进行
系：丙酮酸质量分数 1%，苯酚质量分数 1%， 酶促反应，10 min 取样，用浓盐酸终止酶促反应，
4 mmol/L PLP，氨水调 pH=8.5，温度为 35 ℃， 利用 HPLC 检测反应液中丙酮酸的浓度。
200 r/min 条件下进行酶促反应，10 min 取样，用浓 温度对 TPL 酶活的影响：向 10 mL 含有 0.1 g
盐酸终止酶促反应，利用 HPLC 检测反应液中 L-Tyr 丙酮酸、0.1 g 苯酚和 9.88 mg PLP 的水溶液中加入
的浓度。酶活定义为上述条件下每分钟内催化生成 产 TPL 细胞菌体 0.1 g，pH=8.5，200 r/min 搅拌速
1 μmol L-Tyr 所需要的酶量为一个酶活单位（U）。
度，不同温度条件下进行酶促反应，10 min 取样，
苯酚以及 L-Tyr 色谱条件：色谱柱 WondaSil C18
用浓盐酸终止酶促反应，利用 HPLC 检测反应液中
柱（250 mm×4.6 mm5 μm）；流动相 V〔8.5 mmol/L
L-Tyr 的浓度。
醋酸钠溶液(磷酸调节至 pH=4.0)〕∶V(甲醇)=4∶1； 1.3.3 投酶量的确定
检测波长 230 nm；流速 0.6 mL/min；进样量 20 μL； ALD 投酶量：在 pH=8.5、温度 35 ℃下，向
柱温为室温 [16] 。 100 mL 含有 0.05 mol 甘氨酸、0.13 mol 甲醛和
转化率以苯酚计，计算公式为： 0.4 mmol PLP 的水溶液中加入不同浓度的产 ALD
C  94.11
X /%   100 细胞菌体，转化生成 D-丝氨酸，测定 1 h 产生的 D-
P 181.19
丝氨酸量。
式中：X 为底物转化率，%；C 为转化结束时转化液
SDH 投酶量：向 100 mL 含有 0.05 mol D-丝氨
中 L-Tyr 的质量浓度，g/L；P 为转化结束时加入苯
酸的水溶液中加入不同浓度的产 SDH 细胞菌体，转
酚的总质量浓度，g/L；94.11 为苯酚的相对分子质
化生成丙酮酸，测定 1 h 产生的丙酮酸量。
量；181.19 为 L-Tyr 的相对分子质量。
TPL 投酶量：向 100 mL 含有 0.05 mol 丙酮酸、
1.3 单因素考察
0.05 mol 苯酚和 0.4 mmol PLP 的水溶液中加入不同
1.3.1 pH 对酶活的影响
浓度的产 TPL 细胞菌体，转化生成 L-Tyr，测定 1 h
pH 对 ALD 酶活的影响：向 10 mL 含有 0.1 g
产生的 L-Tyr 量。
甘氨酸、0.1 g 甲醛和 9.88 mg PLP 的水溶液中加入
1.3.4 乙酸铵对 L-Tyr 产量的影响
产 ALD 细胞菌体 0.1 g，温度 35 ℃，200 r/min 搅
在 pH=8.5、温度 35 ℃条件下，向 100 mL 含
拌速度，不同 pH 条件下进行酶促反应，10 min 取
样，用浓盐酸终止酶促反应，利用 HPLC 检测反应 有 2.1 g 甘氨酸、2.1 g 甲醛、2.6 g 苯酚、98.8 mg PLP、
液中 D-丝氨酸的浓度。 6 g ALD、3 g SDH 和 5 g TPL 的水溶液中加入不同
pH 对 SDH 酶活的影响：向 10 mL 含有 0.1 g D- 浓度的乙酸铵行进催化反应，考察不同乙酸铵浓度
丝氨酸的水溶液中加入产 SDH 细胞菌体 0.1 g，温 对 L-Tyr 产量的影响。
度 35 ℃，200 r/min 搅拌速度，不同 pH 条件下进 1.3.5 PLP 浓度对 L-Tyr 产量的影响
行酶促反应，10 min 取样，用浓盐酸终止酶促反应， 在 pH=8.5、温度 35 ℃条件下，向 100 mL 含
利用 HPLC 检测反应液中丙酮酸的浓度。 有 2.1 g 甘氨酸、2.1 g 甲醛、2.6 g 苯酚、0.6 g 乙酸
pH 对 TPL 酶活的影响：向 10 mL 含有 0.1 g 丙 铵、6 g ALD、3 g SDH 和 5 g TPL 的水溶液中加入
酮酸、0.1 g 苯酚和 9.88 mg PLP 的水溶液中加入产 不同浓度的 PLP 行进催化反应，考察不同 PLP 浓度
TPL 细胞菌体 0.1 g，温度 35 ℃，200 r/min 搅拌速 对 L-Tyr 产量的影响。
度，不同 pH 条件下进行酶促反应，10 min 取样，
用浓盐酸终止酶促反应，利用 HPLC 检测反应液中 2 结果与讨论
L-Tyr 的浓度。
2.1 pH 对三酶偶联反应的影响
1.3.2 温度对酶活的影响
温度对 ALD 酶活的影响：向 10 mL 含有 0.1 g 改变反应 pH，其他条件参考 1.3.1，以在不同
甘氨酸、0.1 g 甲醛和 9.88 mg PLP 的水溶液中加入 pH 条件下测得的最高酶活为 100%，分别计算 3 种
产 ALD 细胞菌体 0.1 g，pH=8.5，200 r/min 搅拌速 酶的各自相对酶活，结果如图 1 所示。
度，不同温度条件下进行酶促反应，10 min 取样， 由图 1 可知，ALD 的适宜 pH=7.5，SDH 的适
用浓盐酸终止酶促反应，利用 HPLC 检测反应液中 宜 pH=8.0，TPL 适宜 pH=8.5，在 pH=7.5 时，SDH
D-丝氨酸的浓度。 和 TPL 的酶活较低，在 pH=8.0 时 TPL 的酶活较低，