Page 183 - 201904

第 4 期 王大红，等: L-缬氨酸对 Streptomyces natalensis HW-2 合成纳他霉素的影响 ·709·

[1]
效、广谱的多烯烃大环内酯类抗真菌抗生素 ，能 型高效液相色谱仪，美国 Agilent 公司；恒温摇床，
有效地抑制酵母菌和霉菌的生长，具有低剂量、高 太仓市强乐实验设备有限公司；冷冻高速离心机，
效率、无嗅无味、适用 pH 范围广、专一性好和安 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；超声波细胞破
[2]
全性高等特点 。因此，在食品工业它被用来防止 碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；pH 计，上
[3]
真菌污染 ，美国食品药品管理局和中国卫生部先 海仪电科学仪器有限公司。
[4]
后批准纳他霉素作为食品防腐剂用于食品行业 。 1.1.3 培养基
此外，纳他霉素还成功用于真菌性角膜炎的治疗和 （1）斜面培养基（g/L）：燕麦 20，番茄酱 20，
作为植物保护剂来防治真菌污染 [5-6] 。 琼脂 20；pH=7.2。
纳他霉素的生产主要采用发酵法，研究者采用 （2）种子培养基（g/L）：葡萄糖 10，氯化钠 10，
培养基成分筛选和发酵条件优化、菌种选育、前体 胰蛋白胨 5，麦芽浸粉 5；pH=7.2。
添加和基因工程菌的构建等方式来提高纳他霉素的 （3）发酵培养基（g/L）：葡萄糖 30，酵母膏，
产量 [7-9] 。有研究报道，添加短链羧酸可提高纳他霉 牛肉膏 10；pH=7.2。
素的产量，并缩短发酵周期 [10] ；在发酵过程中添加 1.2 方法
丙醇也可以提高纳他霉素产量 [11] 。相关研究证明， 1.2.1 氨基酸的添加方法
添加氨基酸是提高某些抗生素发酵产量的一种有效 称取一定量的 Val、Leu 和 Ile，在紫外灯下照
方式，特别是添加支链氨基酸，包括异亮氨酸（Ile）、 射 4 h, 根据实验设计加入纳他霉素发酵液中，继续
亮氨酸（Leu）和缬氨酸（Val）,支链氨基酸的代谢 发酵至结束。
产物包括乙酰辅酶 A、丙酰辅酶 A 和丁酰辅酶 A， 1.2.2 纳他霉素发酵
为聚酮类生物合成提供重要前体 [12] 。据报道，添加 将生长于斜面培养基上成熟的纳塔尔链霉菌
L-缬氨酸可提高比特螺旋霉素的产量，比对照组高 HW-2 孢子接于种子培养基中，于 28 ℃、200 r/min
45.3%，葡萄糖消耗率提高到 1 g/(L·h)，丙酮酸在细 条件下培养，2 天后将种子液按体积分数 6%接入发
胞内积累，丙酮酸羧化酶的活性增加了 20%~ 95%， 酵培养基中，28 ℃、200 r/min 培养 5 天，得纳他霉
柠檬酸合酶的活性降低了 41%，丙酸和丁酸的质量 素发酵液。
浓度在发酵液中先增加后减少 [13] 。Hafner [14] 等研究 1.2.3 酶活力测定
发现支链氨基酸能够大幅度提高阿维菌素产量；李 糖酵解途径（EMP）和三羧酸循环（TCA）是
啸 [15] 等证实在培养基中添加支链氨基酸使林可霉素 纳他霉素产生的重要途径，相关酶活力变化反映菌
体内纳他霉素前体的产生情况。EMP 中的己糖激酶
的发酵产量提高了 136%。尽管已有研究证明支链氨
（HK）、磷酸果糖激酶（PFK）和丙酮酸激酶（PK）
基酸能够提高某些抗生素的发酵产量，但支链氨基
是 3 种关键限速酶，分别催化葡萄糖生成 6-P-葡萄
酸对纳他霉素生物合成的影响鲜见报道。
糖、6-P-果糖生成 1,6-2P-果糖和丙酮酸生成乙酰辅
本文以纳塔尔链霉菌 Streptomyces natalensis
酶 A。TCA 循环中柠檬酸合成酶（CS）催化草酰乙
HW-2 为研究对象，探讨 L-缬氨酸（L-Val）对纳他
酸和乙酰辅酶 A 生成柠檬酸，丙酮酸羧化酶（PC）
霉素生物合成及其代谢途径的影响，对于研究微生
和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）分别催化丙酮
物中心代谢途径及其调控机制，阐明纳他霉素合成
酸和磷酸烯醇式丙酮酸生成草酰乙酸。
与 L-Val 代谢的关系，促进纳他霉素的代谢工程研
纳他霉素的生物合成途径如下所示：
究，具有重要的理论意义。
1 实验部分

1.1 材料与仪器
1.1.1 菌株
纳塔尔链霉菌（Streptomyces natalensis）HW-2，
本实验室保藏。
1.1.2 试剂与仪器
纳他霉素，标准品，Sigma 公司；相关酶活试
剂盒，南京建成生物工程研究所；氨基酸，上海蓝
季科技发展有限公司；乙酰辅酶 A 测定试剂盒，索
莱宝科技有限公司。
紫外分光光度计，尤尼柯仪器有限公司；1260