Page 111 - 精细化工2019年第8期
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第 8 期                    潘诗哲，等:  响应面法优化荷叶生物碱盐提取工艺及其纯化                                   ·1599·


            虽然环保，但成本高昂，且 318.45 μg/g 的得率并不                     式中：y 为生物碱得率，mg/g；ρ 为提取液中生物碱
            高 [13-14] ，这些都成为荷叶碱在食品加工中的难题，                      的质量浓度，g/L；V 为提取液体积，mL；m 为荷叶
            且生物碱需在体内脂溶性条件下才可吸收参与代                              粉末质量，g。
            谢，其起效慢、不能完全被利用               [15] 。采用酸溶液将          1.2.3    分光光度法测定荷叶总生物碱
            荷叶碱以盐的形式提取出来，且水溶性物质更利于                             1.2.3.1    荷叶碱标准曲线的绘制       [18]
            人体吸收     [15] 。还有研究表明，荷叶生物碱盐在体内                        将荷叶碱标准品溶解于氯仿，配成质量浓度为
            的降脂减肥效果要优于荷叶生物碱               [16] 。因此，研究荷         0.05 g/L 的母液。分别吸取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL
            叶生物碱盐的提取、纯化的工艺是十分必要的。                              标准品母液于 5 mL 容量瓶中，加氯仿至刻度，振摇，
                 本实验在已有研究的基础上，采用单因素分析                          移至分液漏斗中，加入溴甲酚绿缓冲液 1 mL，振荡
            法，对温度、时间、超声功率、液固比、酸的种类                             30 s 后静置 30 min，取氯仿层，在 415 nm 波长下进
            和质量分数等因素对荷叶生物碱盐得率的影响进行                             行测定，以质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，
                                                                                               2
            考察，应用响应面法优化提取方案，得到最佳的提                             得出回归方程 y=0.0733x+0.0065，R =0.9996，说明
            取工艺参数。用大孔树脂对提取物进行纯化。为更                             荷叶碱在 0~25 mg/L 内线性关系良好。
            经济、环保、实用地研究、开发和利用荷叶资源提                             1.2.3.2    荷叶总生物碱含量的测定        [17]
            供了理论依据。                                                取一定量冻干后的提取物加少量酸水溶解，然
                                                               后加质量分数 2%的 NaOH 调节 pH=10.5，再用氯仿
            1   实验部分                                           90 mL 分 3 次萃取，合并氯仿液并定容至 100 mL，
                                                               取 5 mL 用 0.45 μm 有机相滤膜过滤，接下来的操作
            1.1   原料、试剂与仪器
                                                               同 1.2.3.1，每个试样平行测 3 次，取吸光度平均值，
                 新鲜荷叶，2018 年 7 月采自浙江省建德市；无
                                                               根据回归方程，计算荷叶总生物碱含量。
            水乙醇、盐酸、磷酸、乙酸，分析纯，国药集团化
                                                               1.2.4    UPLC 测定荷叶中生物碱的含量          [19]
            学试剂有限公司；荷叶碱标准品（质量分数>98%）、
                                                                   准确称取荷叶碱、N-去甲基荷叶碱、O-去甲基
            N-去甲基荷叶碱标准品（质量分数>98%），色谱纯，
                                                               荷叶碱标准品及样品粉末，用质量分数 0.2%盐酸溶
            大连美仑生物技术有限公司；O-去甲基荷叶碱标准
                                                               液溶解，过膜，以乙腈为流动相 A，以质量分数 0.1%
            品（质量分数>98%），色谱纯，中国科学院成都生
            物研究所；乙腈、三乙胺，色谱纯，国药集团化学                             三乙胺水溶液为流动相 B，按照表 1 进行梯度洗脱。
            试剂有限公司；D101 型大孔树脂，上海麦克林生物                          流速：1.0 mL/min；检测波长：270 nm；进样量：3 μL；
            有限公司。                                              柱温：25 ℃；最大压力限：60 MPa。以质量浓度为
                 手提式高速万能粉碎机，温岭市林大机械有限                          横坐标，吸光度值为纵坐标，得出荷叶碱的回归方
                                                                                       2
            公司；EON 酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；                             程为 y=7.4461x+14.686，R =0.9991，说明荷叶碱在
            RE-52AAA 旋转蒸发仪，上海嘉鹏科技有限公司；                         0~250 mg/L 内线性关系良好；N-去甲基荷叶碱的回
                                                                                           2
            FD-1C-50 型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限                        归方程为 y=7.9501x1.2818，R =1，说明 N-去甲基
            公司 ； Agilent  1260  Infinity 超高 效液 相色 谱仪           荷叶碱在 0~120 mg/L 内线性关系良好；O-去甲基荷
                                                                                                   2
            （UPLC）、SB-C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，孔径                 叶碱的回归方程为 y=9.7551x+3.5376，R  =0.9915，
            10 nm，粒径 5 μm），美国安捷伦公司。                            说明 O-去甲基荷叶碱在 0~12  mg/L 内线性关系良
            1.2   方法                                           好。
            1.2.1    荷叶的预处理    [12]
                                                                        表 1   梯度洗脱表（体积分数/%）
                 新鲜采摘的荷叶用含 0.1%（质量分数）NaCl
                                                                Table 1    Gradient elution schedule (volume fraction/%)
            的磷酸水溶液（pH=3.0）常温浸泡 3~5 min，淋洗沥
                                                                                         时间/min
            干后 70 ℃鼓风烘干至水质量分数 8%以下，粉碎后
                                                                              0      4      8     10    12
            过 40~60 目筛，再用塑料薄膜袋包装密封，备用。                            流动相 A       80    40     20     10    80
            1.2.2    荷叶生物碱盐的提取       [17]
                                                                  流动相 B       20    60     80     90    20
                 称取一定量的荷叶粉末，加入不同质量分数的
            酸溶液，在不同的液固比、温度、时间、功率下超                             1.2.5    单因素实验  [20-21]
            声提取，过滤后重复提取，然后合并滤液，冻干备                                 在一定条件下，分别考察酸的种类、酸的质量
            用。按照下式计算生物碱的得率：                                    分数、提取温度、液固比、超声功率、提取时间对
                                     V                        荷叶碱得率的影响。以质量分数 0.2%的酸溶液、液
                                y 
                                    m                          固比 30∶1、温度 60 ℃、功率 500  W、提取时间
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