Page 109 - 《精细化工》2020年第4期

第 4 期 曹亚楠，等: 栀子黄色素富集纯化对其抑制 LDL 氧化修饰的影响 ·743·

柱（1.6 cm×20 cm，径高比 1∶5，柱体积为 16 mL）， 1.2.3.2 色价及 OD 值测定
收集流出液。当流出液达到饱和（流出液质量浓度 称取 0.15 g GYP 粉末（精确至 0.0002 g）用水
为进样液的 1/10）停止上样，用 7 BV 水洗除杂， 溶解，摇匀并定容至 100 mL。再吸取 10 mL 该样液
再用 7 BV 体积分数为 20%的乙醇溶液洗去大量绿 转移至 100 mL 容量瓶中，加水摇匀、定容。取此试
原酸和栀子苷，最后用 5 BV 体积分数为 80%的乙 样液置于 1 cm 比色皿中，以水作空白对照，用分光
[9]
醇溶液洗脱栀子黄色素，吸附量（Q e ）、吸附率（E）、 光度计在 238、325、440 nm 处测吸光度 （吸光度
[9]
解吸率（D）计算公式如式（1）~（3）所示 。 应控制在 0.3~0.7 之间，否则应调整试样液浓度，再
 V   V 重新测定吸光度）。色价、OD 1 和 OD 2 的计算公式如
Q  00 1 1 （1）
e
m 式（4）~（6）所示。
 V   V 1% Af 1
E /%  00 1 1  100 （2） E 1cm  440 nm   （4）
V
 00 m 100
 V OD =A 238 / A 440 （5）
1
D /%  44  100 （3） OD =A / A （6）
V 
V 
V 
V
 00  1 1  2 2  3 3 2 325 440
1%
式中：Q e 代表吸附量，mg/g；E 代表吸附率，%；D 式中： E 1 cm （440 nm）代表色价；A 代表稀释后试
代表解吸率，%； 0 、 1 、 2 、 3 和  4 分别代表 GYP 样溶液 440 nm 处吸光度；m 代表试样的质量，g；f
上样液质量浓度、上样流出液质量浓度、水洗流出 代表稀释倍数；A 238、A 325 和 A 440 分别是在 238、325、
液质量浓度、体积分数 20%乙醇流出液质量浓度和 440 nm 处的吸光度。
体积分数 80%乙醇流出液质量浓度，g/L；V 0 、V 1、 1.2.3.3 通过紫外光谱表征 GYP 纯化前后纯度变化
[9]
V 2、V 3 和 V 4 分别代表 GYP 上样液体积、流出液体 根据 CHEN 等 方法稍加修改。精确称取 0.1500
积、水洗液体积、体积分数 20%乙醇洗液流出液体 g GYP-1 和 GYP-2 粉末，加水溶解定容至 100 mL。
积和体积分数 80%乙醇洗脱流出液体积，mL；m 代 取 1 mL 分别定容到 10 和 100 mL，在 200~600 nm
表树脂质量，g。 进行扫描，根据目标产物及主要杂质峰高及相互占
1.2.2.3 动态吸附实验 比评价纯度变化。
采用湿法上样，将预处理好的大孔树脂装入层 1.2.3.4 对纯化前后 GYP 色度进行测定与比较
析柱中，制备好的 GYP 溶液以一定质量浓度及流速 准确称取 0.0100 g GYP-1、GYP-2 粉末，加 20 mL
去离子水溶解，采用色差仪 CIE-Lab 色度空间系统
上柱，收集流出液，达到饱和后停止上样，计算吸
*
*
[9]
附量 。 测定 GYP 溶液颜色 [15] 。其中，L 表示亮度（L 越大，
*
亮度越大；反之，则越小）；a 为红绿色度（正值为
1.2.2.4 动态解吸实验
*
红色方向，负值为绿色方向）；b 为黄蓝色度（正值
按照 1.2.2.3 节筛选出的最佳吸附条件上柱，考
为黄色方向，负值为蓝色方向）。以这 3 个数值用式
察水洗用量、乙醇体积分数、洗脱流速等对树脂解 *
[9]
吸性能的影响，确定最佳洗脱条件 。 （7）计算总色差值（ΔE ），可以客观地表示人眼区
*
分不同物质色泽的能力，ΔE 数值越大，说明色泽差异
1.2.3 GYP 纯化前后各理化性质的测试与比较
[16]
越明显 。
1.2.3.1 各主要成分含量测定
根据陈亮等 [11] 方法测定绿原酸含量、Yang 等 [12]  * ( E  * 0 * )L  2  (L * * 0 ) a  2  ( a * b 0 * ) b  2 （7）
方法测定藏花素及栀子苷含量、魏炜等 [13] 方法测定 1.2.4 GYP 分离纯化放大实验
多糖含量、GOLDRING 等 [14] 方法测定蛋白质含量， 采用放大工艺模拟工业化生产，以验证放大后
各标准曲线如表 1 所示。 原工艺的可行性，保证生产和研发时工艺一致性。
遵循径高比、空间速度不变的原则将小试工艺进行
表 1 标准曲线方程、相关系数及线性范围 放大，树脂柱体积、上样量、水及醇洗用量均增加
Table 1 Regression equations, correlation coefficient and 到原来体积的 29 倍，测定总上样量、总吸附量、吸
linear range
附率、总解吸量、解吸率、OD 1 、OD 2 等相关参数 [17] 。
2
成分 线性方程 线性范围/(mg/L) 相关系数(R )
1.2.5 纯化前后 GYP 抑制 LDL 氧化修饰作用的比较
藏花素 y =0.0849x–0.0075 2.754~16.524 0.9999 1.2.5.1 LDL 制备
栀子苷 y=0.0257x+0.005 6.36~38.16 0.9998 根据 YANG 等 [18] 的方法稍作修改。采用肝素钠
绿原酸 y=0.0699x+0.0041 3~18 0.9999 沉淀法从健康人血浆中提取 LDL，以蛋白浓度确定
多糖 y=0.0116x+0.1068 20~90 0.9992 LDL 浓度，用高盐 PBS（pH=7.4）稀释获得所需 LDL
蛋白质 y=0.0016x+0.0019 25~250 0.9998 浓度。